一株虾青素产生菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种能产虾青素的副球菌及其应用的技术领域。

背景技术：

虾青素 (astaxanthin) 是自然界中抗氧化性最强的一种含酮基类胡萝卜素，其能有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，维持机体平衡和减少衰老细胞的堆积，从而保护皮肤健康，促进毛发生长，缓解运动疲劳，增强人体活力。同时还具有提高免疫力，抗肿瘤，预防心脑血管疾病，延缓衰老等保健功效。作为着色剂，将虾青素添加到果酱、饮料、腌制品及含脂质较多的水产品、肉制品等食品中，不仅能改善产品色泽，增强食用性，还能起到保鲜和防腐的作用。

虾青素的来源途径主要有化学合成和生物提取两种。化学方法合成的虾青素不仅价格昂贵，而且由于产生的虾青素以游离态存在，导致其稳定性和抗氧化活性都比天然虾青素低，且生物对其吸收效果也较差，并且在体内无法转化为天然构型，使得其着色能力和生物效价更比同浓度的天然虾青素低的多。同时利用化学手段合成虾青素的过程中，产生的非天然副产物将降低其生物利用安全性。因此，开发生物来源的天然虾青素，成为当今研究的热点。

现有资料表明，只有单细胞藻类、酵母菌和一些特殊类群的细菌才能产生虾青素。目前虾青素的主要生物来源是红发夫酵母 (Phaffia rhodozyma)和雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis)，但以此生产虾青素存在培养周期长、培养条件复杂、提取分离难度大、产量低等缺陷，且生产工艺达不到工业生产要求。

针对上述问题，我们可以从以下几个方面去努力：(1)对已知的虾青素产生菌进行诱变筛选和发酵优化，建立高效产生菌的种子库，以期达到工业生产要求。(2)在识别微生物产虾青素的功能基因的基础上，对功能基因进行克隆与表达，构建工程菌、提高天然虾青素的产率。(3)开发和利用新型虾青素产生菌，并对该类特殊类群微生物的产生机理、代谢途径进行研究。

技术实现要素：

针对国内外有关生物来源的天然虾青素研究现状，本发明提供一种新的虾青素产生菌。所述的产虾青素菌可利用dextrin、glycerol、L-arabinose、maltose、D-alanine、succinic acid，同时与该属其他菌株的16S rRNA基因序列的最高相似性94.44%至97.18% (EzTaxon)，这些特征明显区别于已公开报道的其他有效菌种。

本发明提供一株副球菌Paracoccus sp. SCU-M53。

本发明通过以不同的温度、pH值、盐浓度和培养基为富集条件，从中华剑角蝗虫组织材料中取样，分离纯化得到多株菌，经过多级筛选确定了一株虾青素产生菌 Paracoccus sp. SCU-M53。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：韩国典型菌种保藏中心（KCTC），保藏时间为2015年11月30日，保藏号是KCTC 42932，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和生物技术研究所，邮编是305-806。该菌为好氧菌，革兰氏阴性，细胞大小为0.4-0.6µm×0.7-1.7µm，菌落颜色为橙红色。氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，能产生吲哚。细胞主要脂肪酸为C_18:1ω7c，summed feature 7 (C_18:1ω7c/ω9t/ω12t)和C_16:0，主要呼吸醌为Q10，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，可利用碳源淀粉、糊精、α-D-葡萄糖、吐温40、吐温80、D-果糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、β-羟基丁酸、α-酮戊二酸、D,L-乳酸、丙二酸、丙酸、琥珀酸、溴代琥珀酸、琥珀酰胺酸、D-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘油，不能利用碳源D-阿拉伯糖、D-纤维二糖、D-半乳糖、龙胆二糖、D-乳糖、乳果糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰基-D-半乳糖苷、D-棉子糖、L-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、侧金盏花醇、赤藻糖醇、m-肌醇、D-甘露醇、阿洛酮糖、D-山梨醇、木糖醇、丙烯三羧酸、柠檬酸、甲酸、D-乳糖酸内酯、D-葡萄糖胺酸、D-葡萄糖酸、α-羟基丁酸、γ-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、衣康酸、α-酮丁酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、癸二酸、溴丁二酸、葡糖醛酰胺、甘氨酰-L-天门冬氨酸、L-组氨酸、羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、D-丝氨酸、D,L-肉碱、γ-氨基丁酸、尿苷酸、肌苷、胸腺嘧啶核苷、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇、丙三醇、D,L-α-磷酸甘油、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖。

对该菌株Paracoccus sp. SCU-M53的形态观察、生理生化及培养特性和化学分类均按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。其中碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系统，呼吸醌组分和细胞内G+C含量采用高效液相色谱法来测定，使用2.5%戊二醛固定细胞后，在扫描电镜下观察该菌的形貌 (图1)，参考菌株为Paracoccus niistensis KCTC 22789^T和Paracoccus chinensis NBRC 104937^T，用于和测试菌株SCU-M53比较。

本发明通过提取总DNA、16S rRNA基因序列的扩增和测序，根据测序结果，在NCBI上用Blast进行比对分析并构建系统发育树，进一步对该菌的分类地位进行判断。

采用Sanger法对Paracoccus sp. SCU-M53的16S rRNA基因测序结果如下 (该序列已在NCBI登记，登录号为KT634253)，全长共1441bp：

CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGACCTTTCGGGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATATGCCCTTCTCTACGGAATAGTCCTGGGAAACTGGGGGTAATACCGTATACGCCCTTTGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTCAAAACTACTGGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGTTGCATGCAATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCAGGACCGCCCGAGAGATCGGGTTTCCACTTCGGTGGCCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCCCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGTGGAAACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCTAACCCTTACGGGAGGCAGCGGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA

基于16S rRNA基因构建的系统发育树可以看出Paracoccus sp. SCU-M53为一个单独分支，该菌Paracoccus sp. SCU-M53与相邻分支上亲缘性最近的两株菌Paracoccus niistensis KCTC 22789^T和Paracoccus chinensis NBRC 104937^T的16S rRNA基因序列相似度分别为96.70%和97.04%，结合表型、生理生化和基因型比较数据，表明菌Paracoccus sp. SCU-M53为副球菌属的一个新种。

通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。

本发明的Paracoccus sp. SCU-M53为好氧菌，革兰氏阴性，菌落呈橙红色。氧化酶和过氧化氢酶阳性。最适pH生长范围为5至9，最适生长盐浓度为0%至1%。该菌具有碱性磷酸酶、酯酶 (C4)、脂肪酶(C8)、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性，可广泛地应用于各类生物工程酶制剂的生产领域。

附图说明：图1是菌株Paracoccus sp. SCU-M53扫描电子显微镜50000倍下照片。

下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。

具体实施方法

实施例一：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53的筛选和分离

实验用蝗虫样品为中华剑角蝗 (acrida cinerea) 的成虫，多分布于农田和菜园，于2014年5月分批次捕捉自四川省成都市大邑县安仁镇菜园 (北纬30°52’, 东经103°62’, 海拔495米)。用无菌水将微生物从蝗虫体表洗脱后，采用稀释平板法涂布至TSB、LB、高氏一号、PDA、牛肉膏蛋白胨和ISP-3培养基上培养，37^oC下培养至可见菌落出现，纯化菌落后进行鉴定。

菌种描述：

好氧菌，革兰氏阴性，菌落呈橙红色。氧化酶和过氧化氢酶阳性。最适pH生长范围为5至9，最适生长盐浓度为0至1%。该菌具有碱性磷酸酶、酯酶 (C4)、脂肪酶(C8)、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性，细胞主要脂肪酸为C_18:1ω7c, summed feature 7 (C_18:1ω7c/ω9t/ω12t)和C_16:0，主要呼吸醌为Q10，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，细胞内G+C含量为60.57%。

实施例二：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53的多相分类鉴定

对该菌株Paracoccus sp. SCU-M53的碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系统，脂肪酸成分测定采用GC-MS分析，酶学特性采用API ZYM试剂条鉴定，参考菌株为Paracoccus niistensis KCTC 22789^T和Paracoccus chinensis NBRC 104937^T。结果如下：

可利用碳源：糊精、α-D-葡萄糖、吐温40、吐温80、D-果糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、β-羟基丁酸、α-酮戊二酸、D,L-乳酸、丙二酸、丙酸、琥珀酸、溴代琥珀酸、琥珀酰胺酸、D-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘油。

具有的酶活性：碱性磷酸酶、酯酶 (C4)、脂肪酶(C8)、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶。

实施例三：16S rRNA基因测序及进化树构建

采用SDS法提取细菌总DNA，通过PCR法扩增菌株16S rRNA基因序列，DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。到GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 数据库将各菌株测得的16S rRNA基因部分序列提交注册获得序列号。再在NCBI (National Center for Biotechnology Information) 上进行BLAST比对，找到亲缘关系最近的菌株。通过BioEdit将亲缘性最近的相应菌株进行序列比对，然后在软件MEGA 5.2上使用Neighbor-Joinin (N-J)法构建系统进化树。PCR相应引物、反应体系、条件如下：引物27F：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R： 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，反应体系 (25μL体系)：Mg²⁺ 2.5μL，27F 2.5μL，1492R 2.5μL，dNTP 0.75μL，H₂O 14μL，Taq酶0.25μL，反应条件95^oC预变性5min，94^oC变性45s，50^oC退火45s，72^oC延伸1min，重复35个循环，72^oC保温10min。

实施例四：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53的应用

将菌种接至TSB培养基中，30^oC培养24-48小时后于培养液中加入2-3mL欧立希氏试剂，若变红色，则为阳性反应，表明有吲哚产生。若不变色或变色不明显，可滴加4-5滴乙醚，仍不呈红色，则为阴性反应。因测试菌株SCU-M53^T的反应结果为红色，证明其有产生吲哚的能力。

实施例五：副球菌Paracoccus sp. SCU-M53产虾青素实验

将菌种接至TSB培养基中，30^oC培养48小时后离心，收集的干细胞采用DMSO进行破壁，然后以丙酮-甲醇 (7:2, v/v) 混合溶剂进行萃取，得到的萃取上清液即可进行HPLC检测。同样，将虾青素标准品溶于丙酮-甲醇 (7:2, v/v) 混合溶剂中，以甲醇-水 (95:5, v/v) 作为流动相，色谱柱为Diamonsil C₁₈柱(250mm×4.6mm, 5um)，检测波长为470nm，通过外标法确定虾青素的出峰时间。通过在同一保留时间出现了色谱峰，证明SCU-M53^T具有在胞内产虾青素的能力。

CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGACCTTTCGGGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATATGCCCTTCTCTACGGAATAGTCCTGGGAAACTGGGGGTAATACCGTATACGCCCTTTGGGGGAAAGATTTATCGGGGAAGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTCAAAACTACTGGTCTTGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGTTGCATGCAATTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCAGGACCGCCCGAGAGATCGGGTTTCCACTTCGGTGGCCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCCCAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTGTGGAAACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCTAACCCTTACGGGAGGCAGCGGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA