抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及抗人平足蛋白(Podoplanin,PDPN)刺激血小板聚集结构域(PLatelet AGgregation-stimulating，PLAG)功能区的单克隆抗体SZ-163和SZ-168及其制备方法；本发明进一步涉及所制备功能性抗体在制备抑制肿瘤生长与转移的药物中的应用；本发明涉及单克隆抗体在建立双抗体夹心ELISA检测人血浆可溶性PDPN中的应用。

背景技术：

由于环境，饮食，生活习惯与工作压力，以及遗传等因素，肿瘤的发生率与死亡率一直居高不下，肿瘤已成为严重危害人类健康的常见病，多发病。肿瘤转移是肿瘤患者死亡的一个主要原因。尽管肿瘤转移的机制长期得到临床医师和科学工作者的重视，迄今对于肿瘤转移的分子机制仍然不太清楚。因此对于如何预防控制肿瘤的转移仍然缺乏有效的手段，预防和抑制肿瘤转移将在相当长的时期内是肿瘤防治中的重点,热点和难点。近几年来，越来越多的证据显示血小板在肿瘤转移中起着重要的作用。血小板在肿瘤转移中的机制可能有以下几种：1.人们发现很多肿瘤细胞直接诱导血小板聚集(释之为：Tumor cell-induced platelet aggregation，TIPA)。活化的血小板释放很多细胞因子，包括血小板衍生血管生长因子等。这些细胞因子能够促进肿瘤细胞的转移和生长，有助于血管的再生；2.肿瘤细胞导致血小板活化通过释放ADP合成血栓烷A2(TXA2)等最后导致整合素糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的活化。肿瘤患者活化性的血小板升高，更加促进了上述过程的发生发展；3.活化的血小板直接粘附在肿瘤细胞表面，从而帮助肿瘤细胞逃避机体的免疫攻击,同时也有助于肿瘤细胞的着床、粘附，从而有利于肿瘤细胞的转移。近年来在肿瘤的治疗中发现，抗血小板聚集药物应用于肿瘤患者的治疗，虽然伴随着出血的风险，但是可以抑制肿瘤的发生发展和转移，因此对抗血小板聚集药物在肿瘤发生发展中的作用机制的研究也许可以为肿瘤的发生，生长，转移与治疗提供新的研究思路与方法。

现有研究表明：在血小板与肿瘤细胞相互作用中起关键作用的分子之一是平足蛋白(Podoplanin,PDPN)，PDPN是I型唾液黏蛋白，最初发现是在淋巴管内皮，也是淋巴管内皮的特异性标志物，在正常组织如肾，肺泡I型细胞等表面表达。PDPN的结构有三部分组成，胞外区是由162个氨基酸组成，含有大量的丝氨酸、苏氨酸残基，其中的EDxxVTPG片段是刺激血小板聚集的结构域(platelet–aggregation-stimulating，PLAG)，位于氨基酸序列的29-54个氨基酸之间，这种序列在物种之间高度保守，PLAG区有三个重复序列组成，主要起作用的是PLAG3，其Thr52作为O-聚糖唾液酸化的位点，跨膜区为单链跨膜，胞内区是由9个氨基酸组成,具有蛋白激酶A/C磷酸化位点；血小板表面表达的CLEC-2是PDPN的内源性受体，与PDPN结合依赖于O-聚糖唾液酸的存在中心，不依赖血浆成分，结合后可以直接诱导血小板的活化聚集，与其他位点结合弱且不诱导血小板聚集，诱导血小板活化聚集有一个延迟的过程。最近发现很多肿瘤细胞(肺肿瘤，胃肿瘤，肠肿瘤，鳞状上皮细胞癌、恶性间皮瘤、Kaposi肉瘤、血管肉瘤、睾丸精原细胞瘤和脑肿瘤等)也表达PDPN，且把PDPN作为新的肿瘤标志物。肿瘤组织表面表达PDPN上调能引起血小板活化，这可能是血小板促进肿瘤的转移与生长的基础。因此，抗PDPN的抗体可能阻止肿瘤的转移与生长，为肿瘤药物的研发提供新的方向。

抗PDPN的PLAG区功能抑制性单抗通过抑制PDPN与CLEC-2的结合，来阻止血小板的活化聚集，这不是生理状态下血小板活化聚集的主要途径，所以抗PDPN抗体不仅能抑制肿瘤的转移，而且不会出现抗血小板聚集药物引起的出血的风险，有很大的应用价值。

因此，研制和开发阻断PDPN的PLAG区与CLEC-2之间相互作用的单克隆抗体，不仅能阻止肿瘤细胞与血小板的结合，从而阻止肿瘤的转移，为肿瘤的治疗提供新的方向与方法；研制的针对PDPN的不同抗原表位的单克隆抗体用于双抗体夹心ELISA方法，在检测癌症等患者的血浆可溶性PDPN水平提供一个可行的方法。血浆可溶性PDPN水平测定可作为一种新的肿瘤标志物作为肿瘤发生和转移的诊断和预后监控和判别。

技术实现要素：

本发明目的是提供抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用，提供的二株抗PDPN的功能性单克隆抗体中，一株能够阻断肿瘤细胞与血小板的结合所诱导的血小板的活化聚集，另一株抗PDPN单克隆抗体能够与第一株功能抑制性抗体结合于PDPN的不同抗原表位。

本发明的另一目的是提供能产生上述特异性抗PDPN的PLAG区的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

本发明的再一目的是提供上述特异性抗PDPN的PLAG区的单克隆抗体在制备抗肿瘤转移药物中的应用及在双抗体夹心ELISA方法制备中的应用。

细胞株的保藏信息为：保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏单位：武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏日期：2016年1月20日，杂交瘤细胞株SZ-163,保藏编号：CCTCC NO:C201613；杂交瘤细胞株SZ-168,保藏编号：CCTCC NO:C2015185。

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，两种杂交瘤细胞株，其制备方法包括以下步骤：

(1)为了增加免疫原性，我们使用人工合成人PDPN的PLAG区的22肽的多肽片段(DTETTGLEGGVAMPGAEDDVVC)与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联作为免疫原(参见实施例1)，以常规方法免疫Balb/c小鼠；

(2)获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

(3)应用ELISA法、流式细胞术和Western印迹法等免疫学技术筛选和鉴定后，挑选出两株具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株SZ-163和SZ-168。(参见实施例2)；

上述技术方案中，使用人工合成22肽-KLH片段作为免疫原，常规三次免疫接种8周龄雌性Balb/c小鼠(每次间隔4周)；用酶联免疫吸附法(ELISA)检测被免疫动物血清中抗PDPN抗体的存在和浓度；免疫完成后，选择产生足够高浓度抗血清的小鼠，分离动物脾脏并制备脾细胞悬液；按照已知的杂交瘤技术(参见：Kǒhler and Milstein，Nature，215：495-497，1975；Kǒhler et al，Immunology Today，4：72-76，1983)将所得到的小鼠脾细胞与骨髓瘤相融合，制备可持续传代并分泌抗PDPN单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

两种抗PDPN的单克隆抗体，所述单克隆抗体属于IgG1亚类抗体，由上述杂交瘤细胞系产生，制备所述单克隆抗体的方法有两种：

(1)在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化得所需的特异性抗PDPN的单克隆抗体；

(2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，动物腹水液中分离和纯化得所需的特异性抗PDPN的单克隆抗体。

可使用间接酶联免疫测定IgG浓度，并可进一步用免疫印迹法(Western-Blot)和流式细胞术(FCM)检测所得单克隆抗体的特异性。本发明中，由两株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体被命名为SZ-163和SZ-168(参见实施例3)。

经用免疫双扩散方法检测，本发明的单克隆抗体属于IgG1亚类抗体。酶联免疫分析方法检测结果显示，本发明的单克隆抗体可与人工合成的PDPN 22肽，即PLAG区以及人肝癌HepG2细胞特异性结合；流式细胞术显示，本发明的单克隆抗体可以与多种人癌细胞特异性结合，如：NCI-H226和转染了PDPN的CHO细胞；另外，我们的免疫印迹分析显示，本发明的单克隆抗体SZ163和SZ168与还原性的PDPN特异性结合，与NCI-H226细胞裂解液结合在分子量36kDa出现结合带，与重组人PDPN-Fc结合在分子量67kDa出现结合带(参见实施例3)。

我们的生物学活性研究表明，本发明的单克隆抗体SZ-168可以有效地阻断表达PDPN的肿瘤细胞诱导的血小板的活化聚集(参见实施例4)。

所述抗PDPN的PLAG区的功能性单克隆抗体SZ168具有抗血小板聚集的作用，在抑制肿瘤转移中的应用。

所述抗PLAG的单克隆抗体在制备抗肿瘤转移药物中的应用。

所述抗PLAG的单克隆抗体在建立双抗体夹心法测定人血浆可溶性PDPN的含量中的应用。

本发明的原理是：抗PDPN的PLAG区的单抗SZ168可与PDPN的PLAG区结合，从而阻断了血小板CLEC-2与PLAG区的结合，抑制了PDPN与CLEC-2结合所诱导的血小板聚集，达到抑制肿瘤细胞转移的目的。

体外实验证明，本发明的抗PDPN的功能性单克隆抗体SZ168，以剂量依赖性方式抑制人癌细胞与血小板的结合(参见实施例4)。

体内试验证明，本发明的抗PDPN的功能性单克隆抗体SZ168能够抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的转移(参见实施例5)。

我们的双抗体夹心实验将单克隆抗体SZ-163作为包被抗体，而SZ-168标记辣根过氧化物酶为检测抗体(SZ-168-HRP)，表明本发明的单克隆抗体SZ-163与SZ-168-HRP能够夹心成功，检测出重组人PDPN，并以PDPN-Fc为标准品，绘制出标准曲线(参见实施例6)。

有益效果：本发明与现有技术相比具有下列优点：

(1)本发明的单克隆抗体可与人PDPN特异性结合，而可以有效地阻断人PDPN与血小板的结合。

(2)本发明的抗PDPN的功能性单克隆抗体SZ-168能够抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的生长和转移。

(3)本发明的两种单克隆抗体SZ-168和SZ-163可以与PDPN的不同抗原表位结合，建立的双抗体夹心ELISA方法，在检测癌症等患者的血浆可溶性PDPN水平提供一个可行的方法。血浆可溶性PDPN水平测定可作为一种新的肿瘤标志物作为肿瘤发生和转移的诊断和预后监控和判别。

附图说明

图1 人工合成的PDPN22肽PDPN的质谱图；

图2 ELISA法检测单克隆抗体SZ-163和SZ-168与人工合成PDPN多肽高特异性结合；

图3 Western-Blot印迹法测定SZ-163和SZ-168与人PDPN特异性结合；A图：18H5为阳性对照抗体，NCI-H226为人非小细胞性肺癌细胞，U87为人脑胶质瘤细胞，CHO-PDPN为重组表达人PDPN的CHO细胞，CHO为阴性对照细胞。B图：SZ-163和SZ-168与重组人PDPN-Fc融合蛋白结合。

图4 流式细胞术法检测单克隆抗体SZ-168与人NCI-H226和CHO-PDPN特异性结合反应；Mouse_IgG为阴性对照，18H5为阳性对照。

图5 单克隆抗体SZ-168能够剂量依赖性地抑制人非小细胞性肺癌细胞NCI-H226诱导的血小板聚集。

图6 单克隆抗体SZ168能够抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的转移。图A显示单克隆抗体SZ168抑制裸鼠体内皮下和肺部肿瘤的生长和转移，箭头所指为肿瘤生长位置。图B为转移到皮下的肿瘤质量分布图，与对照组比较，SZ-168组显著抑制肿瘤的生长和转移，P<0.001。

图7 SZ163与SZ168双抗体夹心ELISA法检测可溶性PDPN的标准曲线，PDPN-Fc为标准品。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：免疫原准备——人工合成人PDPN的PLAG区的22氨基酸的多肽片段(DTETTGLEGGVAMPGAEDDVVC)(质谱图见图1)与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联成DTETTGLEGGVAMPGAEDDVVC-KLH作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。(委托上海紫域生物科技有限公司完成)

实施例2：特异性抗PDPN的PLAG区的单克隆抗体的制备

我们应用常规免疫学方法和杂交瘤技术(Kǒhler and Milstein，Nature，215：495-497，1975)制备本发明的单克隆抗体。

首先，以人工合成的偶联22肽-KLH(DTETTGLEGGVAMPGAEDDVVC-KLH)免疫8周龄雌性Balb/c小鼠(上海科学院实验动物中心)，共免疫三次，每次间隔四周。前两次为背部皮下多点注射加腹腔注射，第三次为经小鼠尾静脉注射加腹腔注射。

待被免疫小鼠的血清抗体滴度达到足够高后，处死动物并分离脾脏细胞。应用标准的单克隆抗体细胞融合技术(Kǒhler and Milstein，Nature，215：495-497，1975)，将被免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞与小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞(法国巴黎输血中心杂交瘤实验室引进)进行细胞融合。在HAT培养基中选择培养融合细胞，培养后取上清以ELISA法筛选出高水平分泌抗体的细胞株。用于进一步的扩大培养或冻存。

应用ELISA法，FCM和Western印迹法等生化和免疫学技术筛选和鉴定后，获得两株特异性抗PDPN的PLAG区的单克隆抗体，分别命名为SZ-163和SZ-168。

为了大量制备单克隆抗体，我们选用BALB/c小鼠，先用降植烷行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中(5×10⁵/小鼠)。大约在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml腹水。

实施例3：本发明单克隆抗体的生物化学性质

(1)应用免疫双扩散方法测定证实，本发明的单抗SZ-163和SZ-168均属于IgG1亚类。

(2)将产生单克隆抗体SZ-163与SZ-168的克隆株接种于Balb/c小鼠腹腔产生腹水，用蛋白G-Sepharose-4B(Pharmacia公司产品)柱纯化，每1mL腹水可纯化得到IgG 1.0mg。

(3)ELISA实验测定SZ-163与SZ-168特异性：将人工合成的PDPN的22肽(1μg/ml)4℃包被过夜，经PBS-0.05％-吐温20洗涤后，用2％BSA-PBS封闭过夜。将SZ-163和SZ-168从1μg/ml的浓度倍比稀释6个浓度(1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml)，37℃反应1.5小时。洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(Beckman-Immunotech公司产品)，37℃反应1小时后，然后加TMB显色。酶联免疫分析法测定显示，SZ-163和SZ-168与人工合成PDPN多肽高特异性结合。(图2)

(4)免疫印迹技术(Western-blot)确定本发明的单克隆抗体识别的抗原分子：重组人PDPN-Fc、U87细胞裂解液、表达重组PDPN的CHO细胞裂解液和NCI-H226细胞裂解液经10％SDS-PAGE分离，并电转移到PVDF膜上。室温用5％的脱脂奶粉封闭1h，PVDF膜与单抗(3μg/ml)4℃过夜，再使结合的单抗与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体室温反应1小时，然后用增强化学发光法(ECL)进行底物显色。Western-blot印迹实验证实，SZ-163与SZ-168可与还原性的PDPN结合，与人非小细胞性肺癌NCI-H226细胞裂解液结合在分子量36kDa出现结合带，与重组人PDPN-Fc结合在分子量67kDa出现结合带，与人脑胶质瘤细胞U87和CHO-PDPN细胞裂解液结合在分子量46kDa出现结合带(图3)。此结果进一步证明SZ-168和SZ-163与人PDPN高特异性结合。

[5]流式细胞术(FCM)确定SZ-168能够与表达PDPN的多种肿瘤细胞特异性结合：培养NCI-H226细胞与表达PDPN的CHO细胞，用0.25％胰酶-EDTA消化收集细胞，细胞浓度为1*10⁶/管，抗体以2μg/管的量与细胞孵育，室温1小时，用PBS洗涤1遍，加入PE-羊抗小鼠的荧光二抗，室温孵育1小时，用PBS洗涤2遍后上机检测。FCM结果显示，SZ-168能够与上述细胞特异性反应(图4)。

实施例4：本发明单克隆抗体阻断肿瘤细胞诱导血小板聚集采集正常健康人全血(3.8％柠檬酸钠1/9抗凝)100×g离心10分钟，取上层富含血小板血浆(PRP)。将各种浓度的单抗(5-10μg/ml)分别与人肿瘤细胞NCI-H226预先冰上孵育15分钟，然后再分别用人肿瘤细胞NCI-H226细胞(1*10⁷/ml)诱导血小板聚集。血小板聚集实验结果表明，抗PDPN单抗SZ-168能够抑制肿瘤细胞诱导的人血小板聚集(图5)。

实施例5单克隆抗体SZ-168能够抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的转移将5-8周的裸鼠(上海科学院实验动物中心)分为实验组与对照组，CHO-PDPN细胞(1*10⁶/只裸鼠)经尾静脉注射到两组体内，对照组注射的是与PBS在冰上孵育30分钟的CHO-PDPN细胞，实验组注射的是与SZ-168(100ug/100ul)在冰上孵育的CHO-PDPN细胞，从注射日开始观察小鼠状态，当裸鼠出现行动力迟缓，呼吸缓慢等时，处死小鼠，计数裸鼠皮下、肺部肿瘤结节的数目、质量与体积，并做统计分析(图6，表1)。结果表明单克隆抗体SZ168抑制裸鼠体内皮下和肺部肿瘤的生长和转移。

表1：

实施例6：单克隆抗体SZ-163与SZ-168建立双抗体夹心法测定人血浆可溶性PDPN的含量将单克隆SZ-163(包被抗体)以10μg/ml包板于96孔酶标板上，100ul/孔，4℃过夜，经PBS-0.05％-吐温20洗涤后，用2％的BSA-PBS封闭过夜，以重组人PDPN-Fc为标准品，以125ng/ml的浓度倍比稀释制备标准曲线7点,每孔加入100ul人血浆样品或标准品，37℃反应1小时；结合的PDPN与辣根过氧化物酶标记单克隆抗体SZ-168(过碘酸钠氧化法,SZ168-HRP)37℃反应1小时。以TMB为底物显色，在450nm下检测吸光度值(图7)。结果表明单克隆抗体SZ-163与SZ-168建立双抗体夹心法(ELISA)可测定人血浆可溶性PDPN的含量，可作为一种新的肿瘤标志物作为肿瘤发生和转移的诊断和预后监控和判别。

<110> 苏州大学附属第一医院

<120> 抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Thr Glu Thr Thr Gly Leu Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala

1 5 10 15

Glu Asp Asp Val Val Cys

20