一种获得生产PF1022的半知菌无孢霉菌的方法与流程

本发明属于菌种的选育
技术领域：
，特别涉及一种获得生产pf1022的半知菌无孢霉菌的方法。
背景技术：
：pf1022a是半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022产生的n-甲基-codp(环状缩肽)类化合物。pf1022a是一种对动物低毒、防治谱广、效果好的驱虫药物，其是继大环内酯类驱虫药后，最有潜力的用于牲畜和宠物的一类驱虫药。美国专利文献us09901393a1(公开日2002年4月18日)公开了一种转化pf1022a生产其衍生物emodepside的化学法。目前emodepside与吡喹酮的组合物profender已上市，用于控制猫或狗胃肠道内的线虫和绦虫。随后emodepside与妥曲珠利的组合物procox也已上市。中国专利文献cn1046940a(公开日1990年11月14日)公开了半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022的性状：菌丝体呈白色绒毛状，7天菌丝体即可覆盖整个培养皿，即形成的菌落的直径大于8.5mm。此外，该菌株不产生有性孢子或无性孢子，在固体平板上菌落的形态差异小，不利于根据表型进行菌株的选择。目前，关于pf1022发酵生产pf1022a的报道比较少，pf1022a的产量又比较低。针对此现状，有必要研究生产高产量的pf1022的半知菌无孢霉菌的方法。技术实现要素：本发明要解决的技术问题就是针对现有的pf1022a产量低、没有关于获得高产pf1022的半知菌无孢霉菌roselliniasp.的方法的不足，提供一种获得生产pf1022的半知菌无孢霉菌的方法，该方法所得的菌株产pf1022a 产量高，重复性好，能够有效获得将pf1022a产量提高至少120％的半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022。本发明人经过仔细的考虑和广泛的研究后发现，通过高渗溶液产生一定的高渗透压的逆境，在该高渗透压的逆境下能够生长良好的半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022具有高产pf1022a的潜能。即与出发菌株相比，在高渗透压的逆境下，菌落直径小、形状圆的半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022单菌落能够高产pf1022a。这样的半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022与在不含高渗溶液的平板培养基中培养获得的半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022相比，产量至少提高120％。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是，一种获得生产pf1022的半知菌无孢霉菌roselliniasp.的方法，其包括以下步骤：1)将野生的半知菌无孢霉菌roselliniasp.pf1022在含有0.1～1.2mol/l的高渗溶液的平板固体培养基中培养，选择菌落直径小于5mm、形状为圆形的单菌落；2)接种步骤1)所得的单菌落至发酵培养基发酵培养，检测发酵物中pf1022a的含量，选择pf1022a含量比出发菌株高的菌株。本发明中，步骤1)为：将野生的半知菌无孢霉菌roselliniasp.pf1022在含有0.1～1.2mol/l的高渗溶液的平板固体培养基中培养，选择菌落直径小于mm、形状为圆形的单菌落。其中，所述高渗溶液的浓度为0.1～1.2mol/l，较佳地为0.3～0.9mol/l，更佳地为0.5～0.7mol/l。所述高渗溶液的溶质为本领域常规的溶质，较佳地为氯化钾、硫酸镁、氯化钠、山梨醇或蔗糖，更佳地为氯化钾或硫酸镁。所述菌落直径小于5mm，较佳地小于4mm，更佳地小于3mm。所述平板固体培养基为本领域常规的平板固体培养基，较佳地为马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基。所述pda培养基为本领域常规的培养基，较佳地由土豆15～20％、葡萄糖2～3％和琼脂1.5～2％组成，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。所述质量体积百分比指每100ml所述pda培养基中，含有组分的克数。如，每100ml所述pda培养基中含有15～20g 土豆。更佳地，所述平板固体培养基由以下的方法制得：将150～200g土豆切成小块放入锅中，加水后加热至沸腾，维持20～30min，用8层纱布过滤，补充水分至1000ml，加入20～30g葡萄糖和15～20g琼脂即可。所述培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～28℃，更佳地为26℃。所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为6～8天，更佳地为7天。所述培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为100μl。较佳地，所述培养还包括以下的步骤：将野生的半知菌无孢霉菌roselliniasp.pf1022稀释。更佳地为，将保存在甘油中的野生的半知菌无孢霉菌roselliniasp.pf1022在匀浆器中碾碎后稀释。所述稀释后的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为103～104个/ml。本发明中，步骤2)为：接种步骤1)所得的单菌落至发酵培养基发酵培养，检测发酵物中pf1022a的含量，选择pf1022a含量比出发菌株高的菌株。其中，所述接种前还包括如下的步骤：接种步骤1)所得的单菌落于斜面培养基中扩大培养得菌落a。所述斜面培养基为本领域常规的斜面培养基，较佳地为马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基。更佳地，所述斜面培养基的组分与步骤(1)所述平板固体培养基的组分相同，但不含高渗溶液。所述扩大培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～28℃。所述扩大培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为5～8天。所述扩大培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为100μl。较佳地，所述扩大培养还包括以下的步骤：挑取步骤1)所得的单菌落，在所述斜面培养基的试管壁上碾碎，再均匀地涂在所述斜面培养基上。较佳地，所述接种的种子液由包括如下的步骤的方法获得：将步骤1)所得的单菌落接种在种子培养基中培养。更佳地，将所述的菌落a接种在种子培养基中培养。所述培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1～2cm2。所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为3～5天。所述培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～28℃。较佳地，所述培养为震荡培养。所述震荡培养的转速为本领域常规的转速，较佳地为200rpm。所述 的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地包括0.5～1.5％葡萄糖、1～3％可溶性淀粉、0.1～0.5％酵母抽提物、0.5～1％麦芽浸粉、0.1～0.5％豆饼粉和0.1～0.4％碳酸钙，所述百分比为占所述种子培养基的总体积的质量体积百分比。所述质量体积百分比指每100ml所述种子培养基中，含有组分的克数。如，每100ml所述种子培养基中含有1～3g可溶性淀粉。所述种子培养基的ph为本领域常规的ph，较佳地为5.5～6.5。所述发酵培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为5～15％，所述百分比为体积百分比。所述发酵培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为6～10天。所述发酵培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～28℃。较佳地，所述发酵培养为震荡培养。所述震荡培养的转速为本领域常规的转速，较佳地为200rpm。所述发酵培养的发酵培养基为本领域常规的所述发酵培养的，较佳地包括2～4％葡萄糖、3～7％可溶性淀粉、0.3～0.5％酵母抽提物、0.5～1％麦芽浸粉、0.5～2.5％豆饼粉和0.1～0.3％碳酸钙，所述百分比为质量体积百分比。所述质量体积百分比指每100ml所述发酵培养基中，含有组分的克数。如，每100ml所述发酵培养基中含有3～7g可溶性淀粉。所述发酵培养基的ph为本领域常规的ph，较佳地为5.5～6.5。本发明所述检测的方法为本领域常规的方法，能够定量发酵物中pf1022a的含量即可。较佳地，所述检测包括以下的步骤：向所述发酵物中加入甲醇，超声后过滤取上清液，hplc法测定所述上清液中pf1022a的含量。所述甲醇的体积为本领域常规的体积，较佳地为所述发酵物的体积。所述超声的温度为本领域常规的温度，较佳地为20℃。所述超声的频率为本领域常规的频率，较佳地为90hz。所述超声的时间为本领域常规的时间，较佳地为20分钟。将本发明所述的方法应用于雀稗麦角菌(clavicepspaspali)时，雀稗麦角菌在含有所述高渗溶液的培养基中不能良好生长，其产生麦角碱的发酵单位略低于不使用本发明所述的方法发酵产生pf1022a的发酵单位。由此可见，本发明所述的方法特别适于roselliniasp.pf1022。此外，本发明所述的 方法不仅适于野生的roselliniasp.pf1022，也适于经过诱变选育(包括uv诱变、ntg诱变、des诱变和ems诱变等)获得的roselliniasp.pf1022。roselliniasp.pf1022对渗透压的耐受能力较高，高渗溶液的浓度最大至1.2mol/l时，roselliniasp.pf1022仍能够生存，可见roselliniasp.pf1022在本发明所述的方法的条件下不存在完全不能存活的可能性。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种获得生产pf1022的半知菌无孢霉菌的方法，该方法所得的菌株产pf1022a产量高，该方法重复性好，能够有效获得将pf1022a产量提高至少120％的半知菌无孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022，可见该方法能够有效地提高pf1022a的产量，从而有利于pf1022a的产业化生产。附图说明图1为未加入高渗溶液的roselliniasp.pf1022菌株的菌落形态。图2为加入0.7molkcl溶液的roselliniasp.pf1022菌株的菌落形态。图3为加入0.9molkcl溶液的roselliniasp.pf1022菌株的菌落形态。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中，若无特别说明，百分比的含义为相对于培养基总体积的质量体积百分比。所述质量体积百分比指每100ml所述培养基中，含有组分的克数。如，葡萄糖1％指每100ml所述培养基中含有1g葡萄糖。实施例中的半知菌无孢霉菌rosellinia.sp.pf1022为购自nitebiological resourcecenter(日本技术评价研究所生物资源中心)，编号为nbrc-33096的rosellinia.sp.pf1022。种子培养基的组成为：1％葡萄糖、2％可溶性淀粉、0.3％酵母抽提物、0.6％麦芽浸粉、0.2％豆饼粉和0.2％碳酸钙，所述百分比为质量体积百分比，用0.3mol/l的盐酸溶液调节所述种子培养基的ph至6.2。发酵培养基的组成为：2％葡萄糖、5％可溶性淀粉、0.4％酵母抽提物、0.8％麦芽浸粉、1.5％豆饼粉和0.2％碳酸钙，用0.3mol/l的盐酸溶液调节所述种子培养基的ph至6.2。hplc测定的条件为：色谱柱为hypersilc18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相为乙腈：水，体积比80:20；流速为1ml/min；柱温为30℃；检测波长为220nm；进样量为20μl；出峰时间为7.3min。实施例1高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和浓度为0.7mol/l的kcl，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。所述高渗平板固体培养基由以下的方法制得：将200g土豆切成小块放入锅中，加水后加热至沸腾，维持20min，用8层纱布过滤，补充水分至1000ml，加入20g葡萄糖、18g琼脂和0.7molkcl即可。斜面培养基的组成除不含kcl以外，其他组分和制备方法均与所述高渗平板固体培养基的组成和制备方法相同。对比平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。(1)、将保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均浆器中碾碎后，稀释至10-3～10-4个/ml得稀释液，取0.1ml稀释液均匀涂布于所述高渗平板固体培养基上和对比平板固体培养基上，置于26℃培养箱中培养7天，随机选择高渗平板固体培养基上的十个单菌落(参见图2)，获得单菌落。(2)铲取2cm2的步骤(1)所得的单菌落的成熟菌苔，在斜面培养基的试管壁上碾碎，均匀地涂于斜面培养基上，26℃条件下中培养6天，得菌 落a。(3)接种2cm2步骤(2)所得的菌落a至种子瓶中的种子培养基，在26℃、200rpm的摇床中震荡培养4天，得种子液。以10％(v/v)的接种量将所述种子液移种于发酵培养基中，在26℃、200rpm的摇床中震荡培养8天，得发酵液。发酵结束后向所述的发酵液中加入等体积的甲醇后超声20min，得超声的发酵液。所述超声的温度为20℃、频率为90hz。将超声的发酵液过滤取上清液，所得的上清液中即含pf1022a。hplc测定所得的上清液中pf1022a的发酵单位，结果如表1所示。表1发酵单位与单菌落形态菌落编号菌落形态菌落直径(mm)发酵单位(g/l)菌落1较大，平6632菌落2大，稍凸，正面呈浅黄色8516菌落3小，圆形2928菌落4较大，形状不规则5775菌落5较小，凸，内部凹陷31017菌落6小，圆形2.5933菌落7较大，形状不规则，凸5821对比菌落大，平，絮状15478表1的结果说明，在使用高渗平板固体培养基进行选择的情况下，所获的菌株的发酵单位的高低与该菌株的单菌落的形态有一定的相关性，单菌落直径越小，如小于5mm时尤其是小于3mm时，且单菌落的形状为圆形，能够获得更高的发酵单位。而对比菌落的菌落形态参见图1。图1说明，由于对比平板固体培养基中没有加入高渗溶液，菌株的菌丝体向平板周围攀爬能力强，产生平铺的形态，不存在显著的形态差异，以至于不能利用形态进行选择。实施例2高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和浓度分别为0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1mol/l的kcl，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。将200g土豆切成小块放入锅中，加水后加热至沸腾，维持30min，用8层纱布过滤，补充水分至1000ml，加入2g葡萄糖、18g琼脂和kcl即可。斜面培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。所述斜面培养基的制备方法与所述高渗平板固体培养基的制备方法相同。(1)、将保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均浆器中碾碎后，稀释至10-3～10-4个/ml得稀释液，取0.1ml稀释液均匀涂布于所述高渗平板固体培养基上，置于26℃培养箱中培养7天，选取菌落直径小于5mm，形状为圆形的单菌落。(2)铲取2cm2的步骤(1)所得的单菌落的成熟菌苔，在斜面培养基的试管壁上碾碎，均匀地涂于斜面培养基上，26℃条件下中培养6天，得菌落a。其余的步骤与实施例1完全一致。计算实施例2所获得的菌株的pf1022a的发酵单位与实施例1所得的对比菌落的pf1022a的发酵单位的比值。若该比值≥120％，则将该菌株记为正突变菌株。其中，正突变率的含义为正突变菌株的数目占实施例2最终获得的菌株的数目的百分比。实施例2所获得的菌株的pf1022a的发酵单位与出发菌株的pf1022a的发酵单位的结果和计算出的正突变率结果见于表2。为了体现实施例2具有良好的重复性，将实施例2的重复3个批次。表2的结果说明，只要运用实施例2的方法，就能使的菌株的pf1022a的发酵单位与出发菌株的pf1022a的发酵单位提高1.2倍以上。可见实施例2能够有效、可靠地获得高产pf1022a的菌株。此外，不同浓度的kcl能够影响pf1022a的发酵单位，随着kcl浓度的增加，所获菌株的正突变率也呈现相 应的增加。其中当kcl的浓度为0.5mol/l或者0.7mol/l时，正突变率增加尤为明显。实施例2重复3个批次所产生的结果一致，说明该方法具有良好的重复性。其中，含有0.7mol/lkcl的平板培养基上菌落生长的形态如图3所示，图3说明，在含有0.7mkcl的平板上，菌落收缩，面积变小，菌体有了一定的厚度，有的甚至会在内部出现凹陷，形态差异大。表2正突变率实施例3高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和浓度分别为0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1mol/l的mgso4.7h2o，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。斜面培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表3所示，表3的数据说明，不同浓度的mgso4.7h2o能够影响pf1022a的发酵单位，随着mgso4.7h2o浓度的增加，所获菌株的正突变率也呈现相应的增加。其中当mgso4.7h2o的浓度为0.5mol/l或者0.7mol/l时，正突变率增加尤为明显。实施例3重复3个批次所产生的结果一致，说明该方法具有良好的重复性。表3正突变率实施例4高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和浓度分别为0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1.2mol/l的nacl，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。斜面培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表4所示，表4的数据说明，不同浓度的nacl能够影响pf1022a的发酵单位，随着nacl浓度的增加，所获菌株的正突变率也呈现相应的增加。其中当nacl的浓度为0.5mol/l或者0.7mol/l时，正突变率增加尤为明显。实施例4重复3个批次所产生的结果一致，说明该方法具有良好的重复性。表4正突变率实施例5高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和浓度分别为0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1.2mol/l的山梨醇，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。斜面培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比(单位g/l)。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表5所示，表5的数据说明，不同浓度的山梨醇能够影响pf1022a的发酵单位，随着山梨醇浓度的增加，所获菌株的正突变率也呈现相应的增加。其中当山梨醇的浓度为0.5mol/l时，正突变率增加尤为明显。实施例5重复3个批次所产生的结果一致，说明该方法具有良好的重复性。表5正突变率实施例6高渗平板固体培养基的组成为：15％马铃薯、3％葡萄糖、1.5％琼脂和浓度为0.7mol/l的kcl，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。斜面培养基的组成为：15％马铃薯、3％葡萄糖和1.5％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。(1)、将保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均浆器中碾碎后，稀释至10-3个/ml得稀释液，取0.1ml稀释液均匀涂布于所述高渗平板固体培养基上，置于25℃培养箱中培养8天，选取菌落直径小于3mm，形状为圆形的单菌落。(2)铲取2cm2的步骤(1)所得的单菌落的成熟菌苔，在斜面培养基的试管壁上碾碎，均匀地涂于斜面培养基上，25℃条件下中培养8天，得菌落a。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表6所示，表6说明，所选择的5个直径小于3mm，形状为圆形的菌落(即菌落1～5)的发酵单位均优于出发菌株。表6发酵单位(mg/l)实施例7高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、2％琼脂和浓度为0.7mol/l的kcl，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。斜面培养基的组成为：15％马铃薯、2％葡萄糖和2％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。(1)、将保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均浆器中碾碎后，稀释至10-4个/ml得稀释液，取0.1ml稀释液均匀涂布于所述高渗平板固体培养基上，置于28℃培养箱中培养6天，选取菌落直径小于4mm，形状为圆形的单菌落。(2)铲取2cm2的步骤(1)所得的单菌落的成熟菌苔，在斜面培养基的试管壁上碾碎，均匀地涂于斜面培养基上，28℃条件下中培养6天，得菌落a。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表7所示，表7说明，所选择的5个直径小于4mm，形状为圆形的菌落(即菌落1～5)的发酵单位均优于出发菌株。表7发酵单位(mg/l)实施例8高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和0.3mol/lnacl和0.5mol/l的kcl，余量为水，所述百分比为质量体积百分 比。斜面培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表8所示，表8说明，使用两种或多种溶质形成高渗条件，也能够达到选择获得正突变率高的菌株的目的。表8正突变率正突变率(％)获得菌株对比菌株批次14.42.1批次24.81.9批次34.92.2对比例1高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和浓度为0.05mol/l的kcl，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。斜面培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表9所示，表9的数据说明，用含有浓度过低的高渗溶液的高渗平板固体培养基培养，菌落形态差异不明显，难以根据选择得到正突变高的菌株。表9正突变率正突变率(％)获得菌株对比菌株批次12.02.1批次21.91.9批次32.32.2对比例2高渗平板固体培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖、1.8％琼脂和浓度为1.5mol/l的kcl，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。斜面培养基的组成为：20％马铃薯、2％葡萄糖和1.8％琼脂，余量为水，所述百分比为质量体积百分比。其余所有条件均与实施例2完全一致。结果如表10所示，表10的数据说明，用含有浓度过高的高渗溶液的高渗平板固体培养基培养，由于产生了严重的高渗逆境，影响正常的代谢功能，因而正突变率严重下降。表10正突变率正突变率(％)获得菌株对比菌株批次10.92.1批次21.01.9批次30.72.2应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12