本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类含有乙炔基的苯甲酰胺类化合物，或此类化合物药学上可接受的盐，单独或任选地与一种或多种其他药学活性化合物联合用于治疗对于抑制蛋白激酶活性有响应的疾病，尤其是白血病。
背景技术：
蛋白激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将atp的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。这些磷酸化充当可调节或调控目标蛋白质的生物功能的分子开/关的转换器，最终回应于多种细胞外和其它刺激物而被触发。这些刺激物包括环境和化学应激信号(例如休克、热休克、紫外线照射、细菌内毒素和h2o2)、细胞因子(例如包细胞借宿-1和肿瘤坏死影子α和生长因子)。细胞外刺激物可能会影响细胞生长、迁移、分化、激素分泌、转录因子活化、肌肉收缩、葡萄糖代谢、蛋白质合成控制等一种或一种以上的细胞反应。
蛋白激酶活性的失常，可以引起许多相关的疾病。这些疾病包括癌症、自体免疫性疾病、炎症、代谢性疾病、神经性疾病、心血管疾病合阿兹海默氏症(alzheimer’sdisease)等。在很多情况下，可以通过体外和体内利用蛋白激酶抑制剂来治疗这类疾病。
abl(abelsonleukemiavirus)酪氨酸激酶存在于细胞质和细胞核中，在细胞分化、分裂、细胞黏附和应激反应过程中起重要作用，基因转位导致b细胞受体(bcellreceptor,bcr)和abl基因头尾融合形成融合基因bcr-abl。bcr-abl激酶有多个功能结构域，包括sh2、sh3结构域、核定位结构域和3个dna结构域，其激活有助于白血病的发生。酪氨酸激酶活性对于bcr-abl的功能是必需的，bcr-abl激活的某些信号途径与造血生长因子激活的途径相似，如ras、pi3k、jak/stat等。bcr-abl的过度激活改变造血细胞的黏附性、诱导细胞骨架功能异常，通过多种途径干扰细胞周期和细胞黏附，促进肿瘤的发生和发展。
20世纪90年代初发现的imatinib能够特异性的抑制bcr-abl酪氨酸蛋白激酶的活性。它在微摩尔浓度下即能有效抑制abl、血小板生长因子受体(pdgfr)、kit受体和arg酪氨酸激酶的自磷酸化，成为了临床上治疗白血病的一线重要药物，但病人长期使用后发现了耐药现象。研究发现耐药性的分子基础是bcr-abl的激酶结构区域出现对imatinib抗性的变体，突变体包括y253h、e255v、e255k、f359v、t315i、g250e、f317l、e355g、h396p、m351t、m253h、l248v、q252h、y253h和y253c等。
鉴于蛋白激酶抑制剂数量之大和增殖性及其他蛋白激酶相关的疾病种类之多，而且现有药物出现了耐药性等问题，我们需要开发新的种类的化合物，以用作蛋白激酶抑制剂，用于治疗这些蛋白激酶相关的疾病。因此，本发明发现了一种含有乙炔基的苯甲酰胺类衍生物，用于预防或治疗与蛋白激酶活性异常或失控相关的疾病。而且经过前期的研究，发现本发明所提供的化合物对急性早幼粒细胞白血病具有很好的抑制作用。
技术实现要素：
本发明提供了一种下面通式(ⅰ)表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中
r1表示一个5、6或7元含氮或含氧或含硫的杂环基，该杂环可以被低级烷基，卤素，羟基，氨基，巯基取代；
r2是氢，氟或三氟甲基；
r3是含氮、硫或氧的杂环，或与相连的嘧啶形成稠环化合物。
在本发明所述的化合物(ⅰ)或其药学上可接受的盐，其中
r1所述的杂环优选自咪唑，吡咯；
r2优选为三氟甲基；
r3优选自吡啶基，吡咯基，噻吩基；或与相连的嘧啶形成嘌呤基，硫代嘌呤基。
本发明所述式(ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的化合物更优选自：
本发明所述式(ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐，或含至少一个碱性成盐基团，与其成盐的酸可以是药学上常用的无机酸或有机酸，包括无机酸：盐酸、硫酸、磷酸；有机羧酸：乙酸、丙酸、三氟乙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、各种天然的或合成的氨基酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、扁桃酸、肉桂酸、烟酸、异烟酸；有机磺酸：甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、2-萘磺酸。当存在 多个碱性基团时，可以生成多酸加成盐。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐还包括溶剂化物或水合物的形式。一般来说，溶剂化物或水合物的形式与非溶剂化的或非水合的形式等同，一并涵盖在本发明的范围内。本发明中的有些化合物有可能存在多晶体或无定形的形式。总的来说，所有的物理形式具有同等的用途，并且涵盖在本发明的范围内。
本发明涵盖呈混合物形式或者呈纯形式的本发明化合物的所有立体异构体。本发明化合物的定义包含所有可能的立体异构体及其混合物。其非常具体地包含外消旋形式和分离的具有特定活性的光学异构体。外消旋形式可通过物理方法来进行拆分，所述物理方法诸如对非对映异构体衍生物进行分级结晶、分离或者通过手性柱色谱进行分离。可通过常规方法例如光学活性酸形式成盐接着结晶而从外消旋体得到单独的光学异构体。
本发明还包括所述化合物的前药。前药是由母体药物衍生而来的一种化合物，其一旦进入体内，前药就被代谢转变为母体药物。前药可通过对母体药物的一个或多个官能团进行取代而制备，其取代基团可在体内被酶催化而释放出母体化合物来。前药的制备和使用可在t.higuchiandv.stella,“pro-drugsasnoveldeliverysystem”,vol.14ofthea.c.s.symposiumserier和bioreversiblecarriersindrugdesign,ed.edwardb.roche,americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress,1987中找到。
此外，本发明还提供了一种合成化合物(ⅰ)的方法。
本发明所述的化合物(ⅰ)可通过化合物a和化合物b连接得到，合成方法如下：
在该合成方法中，所用溶剂一般为dmf、dmso、n-甲基吡咯烷酮等大极 性非质子溶剂，并且加入含有钯的催化剂，如氯化钯、醋酸钯、三苯基磷基钯等，并加入适当的有机碱，如三乙胺，二异丙基乙胺、dmap等。反应一般在较高的温度(如大于100℃)下进行，反应结束后可用柱色谱等手段分离提纯反应物。
反应式中，化合物a一般可通过以下方法获得：
化合物c经过重氮化、上三甲基硅基乙炔、脱去三甲基硅基保护基三步反应得到化合物a。其中重氮化是通过nano2/hbr或者亚硝酸叔丁酯/hbr反应实现的。重氮化的产物d与三甲基硅基乙炔在极性非质子溶剂中反应生成化合物e，反应中加入含钯化合物作为催化剂，有机胺作为碱。然后化合物e脱去tms保护基，该反应可以在适量的四丁基氟化铵的条件下轻易完成。
此外，化合物b可以通过下面的方法合成：
该反应是氨基和羧酸生成酰胺的反应，可以用本领域技术人员所熟知的方法完成，包括羧基生成酰氯后与氨基反应、或通过活性酯中间体直接合成酰胺。
本发明还涉及包含有效量的式(ⅰ)化合物和药理上可接受的载体的药物组合物，该组合物适用于局部的、肠内的或肠外的给药，可以是无机的或有机的，固态的或液态的。对于口服，尤其用片剂或胶囊。这种片剂或胶囊包含活性成分和稀释剂(如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨醇、纤维素、丙三醇)，润滑剂(如滑石、硬脂酸盐)，聚乙二醇。片剂还可包含粘合剂，淀粉，明胶，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，必要时还可包含粉碎剂(如淀粉、琼脂、藻酸及其盐)，泡腾混合物，或吸附剂，染料，调味剂，增甜剂。这些组合物还可以肠胃外给药的形式或以针剂的形式被适用。此类剂型优选等渗水溶液或乳液，如在仅由活性成分和一种载体(如甘露醇)组成的冻干组合物的情况下，此类溶液可以在使用前制备。这些药物组合物可以是无菌的，或包含赋形剂的，或加溶剂、调节渗透压的盐。
本发明还提供了一种调节蛋白激酶活性的方法，其中包括将所述蛋白激酶 与式(ⅰ)化合物接触。其中所述蛋白激酶选自其中所述蛋白激酶选自abl，bcr-abl。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含有效治疗量的能够预防或治疗蛋白激酶相关疾病状态的式(ⅰ)化合物，和药学可接受的载体或稀释剂。
本发明还提供了式(ⅰ)化合物在制备用于治疗疾病或失调的药物中的应用，其中所述的疾病或失调是与蛋白激酶活性相关的或与细胞增殖异常相关的，如癌症，炎症，自身免疫性疾病，代谢性疾病，中枢神经系统疾病和心血管疾病。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的示例性实施方案。然而，这些实施方案仅为说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
以下是可在本说明书中使用的术语的定义。除非另有说明，本专利就基团或术语而言提供的初始定义适用于在说明书通篇中的所述基团或者术语，不论是单独使用还是作为另一基团的部分使用。
术语“烷基”是指直链的或支链的未取代的烃基，其具有1-20个碳原子，优选的是1-6个碳原子，尤其是指甲基、乙基、丙基(包括正丙基和异丙基)、丁基(包括正丁基、异丁基、叔丁基)等。
术语“炔基”是指具有一个多个碳碳三键的烃基，如乙炔基、丙炔基等。
术语“卤素”或者“卤代”是指氟(氟代)、氯(氯代)、溴(溴代)、碘(碘代)。
术语“杂环芳基”是指任选取代的芳香族环状基团，其中至少含有一个碳原子被其它杂原子取代，杂原子包括氮、氧、硫。该氮和硫杂原子也可任选被氧化，氮杂原子也可任选被季铵化。该杂环基团可在任何杂原子或碳原子处连接。优选的杂环芳基包括但不限于，吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪、呋喃、噻吩、咪唑、三唑、四唑、噻唑、异噻唑、吡咯、吡唑、噁唑、异噁唑、苯并呋喃、苯并噻唑、苯并噻吩、吲哚、喹啉、异喹啉、嘌呤、咔唑、苯并咪唑、吡咯并吡啶、吡咯并嘧啶等。
术语“杂环烷基”是指非芳香杂环，其中一个或多个成环原子是杂原子，如氧、氮、硫原子。杂环烷基可以包括单环或多环(如有2、3、4个稠合环)、螺环。优选的杂环烷基包括氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、咪唑烷、吡唑烷、吗啉、硫代吗啉、哌嗪、 哌啶等。杂环烷基还包括具有一个或多个芳香环稠合的杂环，例如2,3-二氢苯并呋喃、1,3-苯并二氧戊环、苯并-1,4-二噁烷、苯二甲酰胺等。具有一个或多个芳香环稠合的杂环烷基可以通过芳香环或非芳香环部分与其它基团连接。
术语“酰胺基”是指基团-c(＝o)nh-。
术语“氰基”是指基团-cn。
术语“烷氨基”是指被一个烷基取代的氨基。
术语“二烷基胺”是指基团被二个相同或不同的烷基取代的氨基。
术语“羧基”是指基团-cooh。
术语“烷碳基”是指基团-c(＝o)r，其中r是指烷基
“可选的”意味着随后描述的事件或情况可以发生或者不发生，所述描述摆阔其中所述事件或情况发生的例子和其中它不发生的例子。
本文所用的“药学可接受的载体”包括任何核全部的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌药剂、等渗和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药学活性物质在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，其在治疗组合物中的应用时可预期的。补充的活性成分也可并入组合物中。
实施例1
4-甲基-n-(3-(4-甲基-1h-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-((4-(哌啶-3-基)嘧啶-2-基)乙炔基)苯甲酰胺
i)3-(4-甲基咪唑-1-基)-5-三氟甲基苯胺
在装有氩气保护的三口烧瓶中，加入3-溴-5-三氟甲基苯胺(48g，0.2mol)、4-甲基咪唑(19.7g，0.24mol)、碘化亚铜(5.7g，0.03mol)、8-羟基喹啉(4.4g，0.03mol)、碳酸钾(30g，0.22mol)和300mldmso，搅拌，加热至120℃，反应24h，tlc跟踪，反应结束后，降温至50℃，加入200ml14％的氨水，继续搅拌1h，降温后，加入100ml水，乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和食盐 水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸除去部分溶剂。然后将溶剂放入冰箱中冷却结晶，过滤析出的晶体，干燥后得到淡绿色针状晶体33.7g，收率70％。ms(m/z)＝241.2。1hnmr数据(500mhz，cdcl3)：8.10(s，2h，咪唑)，6.91-6.75(m，3h，苯环)，4.20(s，2h，氨基)，2.22(s，3h，甲基)。
ii)3-碘-4-甲基-n-(3-(4-甲基-1h-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺
在烧瓶中加入二氯亚砜250ml、3-碘-4-甲基苯甲酸26.2g，搅拌，加热回流6h，减压浓缩干之后，再加入干燥的二氯乙烷，减压除去溶剂。依次加入氯仿250ml，二异丙基乙胺20ml，3-(4-甲基咪唑-1-基)-5-三氟甲基苯胺24.1g，升温至60℃，反应5h，tlc跟踪。反应结束后，减压浓缩，除去溶剂。加入乙酸乙酯200ml溶解，水洗3次，干燥，浓缩，得到的固体用柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇＝9，收集所需的馏分，浓缩后得到固体28g，收率57％。ms(m/z)＝485.2。1hnmr数据(500mhz，dmso-d6)：10.32(s，1h，酰胺)，8.28-7.15(m，8h，苯环及咪唑环)，2.33(s，3h，-ch3)，2.23(s，3h，-ch3)。
iii)2-乙炔基-4-(吡啶-3-基)嘧啶
2-溴-4-(吡啶-3-基)嘧啶12g，溶于120mldmf中，加入三甲基硅基乙炔20ml，碘化亚铜1g，氯化钯0.5g，dipea20ml，在密闭压力容器中加热到120℃，反应3h后，冷却并将反应液倒入烧杯中，加入乙酸乙酯200ml，水洗3次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得到2-三甲基硅基乙炔基-4-(吡啶-3-基)嘧啶8.5g，收率：66％。
将上一步反应产物溶于70mlthf中，加入四丁基氟化铵6.6g，常温反应3h，tlc跟踪，反应完成后，将反应液浓缩至干。加乙酸乙酯100ml溶解，水洗2次，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得到固体2-乙炔基-4-(吡啶-3-基)嘧啶5.2g，收率87％。ms(m/z)＝181.2。1hnmr数据(500mhz，dmso-d6)：9.24-8.42(m，5h，杂环)，7.57(s，1h，杂环)，4.08(s，1h，炔基)。
iv)4-甲基-n-(3-(4-甲基-1h-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-((4-(哌啶-3-基)嘧啶-2-基)乙炔基)苯甲酰胺
将2-乙炔基-4-(吡啶-3-基)嘧啶3g和3-碘-4-甲基-n-(3-(4-甲基-1h-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺8g溶于100mldmf中，加入dipea10ml和二 氯化钯0.1g，搅拌，加热至100℃，反应3h，tlc跟踪。反应结束后，浓缩，柱色谱分离。洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(9/1)，收集所需馏分后，浓缩，得到浅黄色固体即为标题所述化合物，产量5.4g，收率58％。ms(m/z)＝538.5。1hnmr数据(500mhz，dmso-d6)：10.23(s，1h，酰胺)，9.24-7.21(m，13h，苯环及杂环)，2.45(s，3h，-ch3)，2.23(s，3h，-ch3)。
实施例2
4-甲基-n-(3-(4-甲基-1h-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-((4-(哌啶-3-基)嘧啶-2-基)乙炔基)苯甲酰胺甲磺酸盐的制备
将实施例1所得到的化合物5.4g溶于250ml丙酮，加入一水合柠檬酸3g，搅拌溶解，加热回流1h，有固体析出，冷却，过滤。将过滤得到的固体溶于500ml水中，滴加1％的氢氧化钠溶液，调节ph值到9左右，过滤，再将得到的固体重复以上操作一次。
将提纯后的产物再溶于丙酮，加入适量的甲磺酸，搅拌，加热回流1h，有固体析出，冷却，过滤，干燥，即得。
实施例3
4-甲基-n-(3-(4-甲基-1h-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-((4-(哌啶-3-基)嘧啶-2-基)乙炔基)苯甲酰胺盐酸盐的制备
将提纯过的4-甲基-n-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-((4-(哌啶-3-基)嘧啶-2-基)乙炔基)苯甲酰胺溶于乙醇中，加入10％的盐酸溶液，搅拌，加热到60℃，反应2h，反应结束后，减压蒸馏除去乙醇，加入丙酮，搅拌30min，有固体析出，过滤，干燥，即得。
按照实施例1所述的相似的方法，以不同的起始物制备以下化合物：
实施例17药物制剂配方
本发明提供了几种用于治疗或预防与蛋白激酶相关的疾病的药物组合物的配方，其药物组合物有片剂、胶囊、注射剂、气雾剂等。以下以“活性化合物”表示本发明所示的化合物。
实施例18体外活性测试
本发明的化合物对蛋白激酶活性的调节和细胞增殖的抑制作用进行了测试，对bcr-abl突变的k562(人白血病细胞)和hl-60(人早幼粒白血病细胞)进行了测试，其方法如下：
取对数生长期的两种细胞，制成单细胞悬液，分为2组:空白对照组、2μmol/l活性成分组。细胞悬液终浓度为5×104/ml。以200μl/孔种入96孔板。 置于含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，在37℃、5％co2孵箱中分别培养72h，每组每浓度设3个复孔，根据细胞生长情况及时添加培养液。细胞终止培养前4h加入5g/lmtt20μl，继续培养4h后加150μl二甲基亚砜(dmso)终止反应，振荡10min，取充分混匀的细胞悬液在血球计数板上计数细胞数，细胞计数以n×104/ml表示，并计算抑制率。
表1活性化合物对细胞活性抑制情况
从表1所示结果可以看出，本发明实施例所示化合物都具有抑制白血病细胞活性的能力，尤其对人早幼粒白血病细胞效果更佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同， 也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。