一种突变的MSH6蛋白及其编码基因、应用的制作方法

本发明涉及生物化学
技术领域：
，特别涉及一种突变的msh6蛋白及其编码基因、应用。
背景技术：
：林奇综合征定义为由错配修复(mmr)基因突变引起的对结直肠癌及某些其他癌症(如子宫内膜癌、胃癌、脑癌等)的遗传易感性。人体的细胞处于不断的分裂、增生和分化过程中，而细胞中的遗传物质dna也不断复制并传给子细胞。在dna复制过程中不可避免地会出错，使子细胞获得错误的遗传信息。当dna复制出错时，mmr基因就会表达出错配修复蛋白，对错误复制的dna进行“纠错”，保证遗传物质稳定而准确的传递。林奇综合征患者因mmr基因突变而丧失了错配修复功能，基因突变率升高，完成突变累积的时间缩短，肿瘤风险极大提高。林奇综合征是一种常染色体显性遗传病，患者的临床特征是结直肠癌的风险很高，且发病年龄较早；此外，患者子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、肝胆肿瘤、尿道肿瘤、胰腺癌及小肠癌等肿瘤的风险也显著高于普通人群。四种与林奇综合征发生密切相关的基因分别为mlh1、msh2、msh6及pms2，国际研究发现林奇综合征家系中mlh1及msh2基因的突变检出率可达85％-90％，msh6突变检出率约为10％-15％，pms2基因的突变较少见。目前，林奇综合征相关基因突变谱尚未完全发现，基因型与表型的关系也不明确。林奇综合征是最常见的结直肠癌遗传形式，每35例新诊结直肠癌患者中即可检出1例林奇综合征。目前公认的最准确、最可靠的诊断林奇综合征的方法是mmr基因突变检测阳性结果。基因检测在美国已有二十余年的历史，从1994年至2005年，由于基因检测预警及医疗水平的提高，美国家族性大肠癌的发病率降低了90％。2014年，美国国家综合癌症网络(nccn)推荐新诊结直肠癌患者普查林奇综合征。为提高林奇综合征筛查或普查的效率、准确性，扩充遗传咨询及健康管理的依据，本领域迫切需要对林奇综合征相关基因突变谱进行完善，对基因型及表型的关系进行补充。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种突变的msh6蛋白及其编码基因、应用。该突变的msh6蛋白及其编码基因的发现可用于筛查、诊断或辅助诊断林奇综合征。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种突变的msh6蛋白，突变的msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。本发明研究发现该突变的msh6蛋白前195位氨基酸与野生型msh6蛋白(野生型msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示)相同，突变的msh6蛋白的第195位缬氨酸后发生移码突变，蛋白终止于第210位。本发明还提供了一种编码突变的msh6蛋白的基因，其核苷酸序列如seqidno:3所示。本发明研究发现，与编码野生型msh6蛋白的核苷酸(编码野生型msh6蛋白的核苷酸序列如seqidno:4所示)序列相比，编码突变的msh6蛋白的核苷酸序列的第586位发生了t核苷酸的缺失，编码核苷酸由4083个碱基减少到630个碱基。在本发明中，突变的msh6蛋白或其编码核苷酸序列来源于人或非人哺乳动物，较佳地来源于人。本发明还提供了一种筛查、诊断或辅助诊断林奇综合征的试剂盒，该试剂盒包括：检测氨基酸序列如seqidno:1所示msh6蛋白第196-209位氨基酸位点的试剂。在本发明提供的一些实施例中，试剂为抗体。在本发明中，抗体为特异性结合于第195位缬氨酸后发生移码的14个氨基酸(第196-209位氨基酸位点)的多肽。本发明还提供了一种筛查、诊断或辅助诊断林奇综合征的试剂盒，该试剂盒包括：检测核苷酸序列如seqidno:3所示msh6基因第586位核苷酸位点的试剂。在本发明提供的一些实施例中，试剂为引物对、探针或核苷酸芯片。在本发明中，引物对为可特异性扩增出含586位碱基的核苷酸序列。优选地，引物对扩增出的扩增产物的长度为100～1000bp。在本发明中，探针为可特异性结合于含586位缺失t的msh6基因的核苷酸片段。作为优选，引物对的正向引物核苷酸序列如seqidno:5所示，反向引物核苷酸序列如seqidno:6所示。本发明还提供了一种非诊断目的检测核苷酸序列如seqidno:3所示msh6基因的方法，包括：采用正向引物核苷酸序列如seqidno:5所示、反向引物核苷酸序列如seqidno:6所示的引物对扩增样本dna，测序。作为优选，扩增的反应体系为：作为优选，扩增的程序为：本发明提供了一种突变的msh6蛋白及其编码基因、应用。突变的msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示；其编码基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。该突变在林奇综合征患者中高度保守，利用该突变可以对林奇综合征患者或林奇综合征高风险人群进行筛查和诊断。附图说明图1为显性林奇综合征家系图谱；图2示msh6基因突变的sanger测序结果，图2a为c.586delt的杂合突变谱，图2b为msh6基因野生型检测结果，图2c为msh6基因发生c.586delt突变，导致读码框发生移码。具体实施方式本发明公开了一种突变的msh6蛋白及其编码基因、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明经过广泛而深入的研究及大规模的筛选，首次意外地发现一种林奇综合征致病基因msh6基因的新突变。具体地，发明人以林奇综合征患病家系为研究对象，对该家系中的患癌个体和未患癌个体进行了mlh1、msh2、msh6及pms2基因的全外显子及±10bp内含子区域的测序和比较，意外地在msh6基因第3个外显子中发现一个移码突变(c.586delt)，该突变造成msh6蛋白的195位之后的氨基酸发生移码，并于210位出现终止密码子；发明人进一步发现，该突变在同一家系中所导致的肿瘤类型及发病年龄有较大差异。在此基础上完成了本发明。术语解释：外显子：“外显子”是指既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的mrna分子中的核苷酸序列。内含子是在mrna加工过程中被剪切掉的、在成熟mrna中不存在的核苷酸序列。外显子和内含子都是对于基因而言的，编码蛋白的部分为外显子，不编码的为内含子。引物：“引物”指的是能与模板相互互补配对，在dna聚合酶的作用下合成与模板互补的dna链的寡聚核苷酸的总称。引物“基本上”(或“大致上”)与模板上一条链的一段特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但不必完全互补。比如，一段长29bp的引物，其中第15位核苷酸与模板不互补，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分结合，非完全互补的引物也可以与模板形成模板-引物复合物，从而进行扩增。dna文库：“dna文库”指的是连有相应接头的一系列dna片段，其长度和接头序列都适于测序仪进行处理。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1与林奇综合征相关的基因突变的发现在本发明的具体实施例中，发明人对mlh1、msh2、msh6及pms2四个基因的编码区外显子、关键utr区和选择性剪切位点设计多重引物序列，然后采用新一代高通量靶向重测序技术，对四代家系(家系成员情况见图1、表1)中的三个患病个体(ⅱ-2，ⅱ-3和ⅲ-2)和两个非患病个体(ⅲ-1，ⅳ-1)及20例无肿瘤家族史的正常人的编码区外显子、关键utr区和选择性剪切位点进行了测序。结合生物信息分析发现了msh6基因的c.586delt突变与林奇综合征的发生相关。并通过正常人样本筛选和sanger测序验证了这个变异。表1各家系成员所患肿瘤类型、肿瘤确诊年龄信息具体步骤如下：1.样本采集采集了林奇综合征四代家系中3例患癌成员及2例未发生肿瘤成员的外周血样本，并采集了20例无肿瘤家族史的正常人外周血样本，edta抗凝，-80摄氏度保存。2.文库制备和测序登录ampliseq.com，提交mlh1、msh2、msh6及pms2四个基因的编码区外显子、关键utr区和选择性剪切位点设计多重pcr引物，得到一套引物组合物。引物组合物包含如下引物序列：序列5(检测msh6基因c.586delt突变的上游引物序列，见序列表中seqidno:5)：5’aaatacatttctttctaggttcaaaatcaaagg3’；序列6(检测msh6基因c.586delt突变的下游引物序列，见序列表中seqidno:6)：5’caccctaacataaataacaactgaatgcttg3’。采用life公司ionampliseqtmlibrarykit2.0试剂对5例家系样本和20例正常对照样本进行文库制备和合并。合并后的文库采用bioelectronseq4000测序仪进行测序，读长约200bp。下述方法中的步骤(c)、(d)、(f)和(g)所用试剂均是life公司生产的ionampliseqtmlibrarykit2.0试剂，(e)中所用接头来自life公司生产的ionxpressbarcodeadaptors1-96kit试剂。(a)基因组dna的提取提取各外周血样本的基因组dna，提取方法可参照《分子克隆实验指南》中提供的基因组dna提取方法，也可购买商品化试剂盒，按照说明书提取。(b)基因组dna的质控对提取的基因组dna进行质控，nanodrop2000分光光度计测纯度，要求od260/od280在1.8～2.0之间；qubit荧光光度计测定浓度，要求浓度不低于20ng/μl，总量不低于100ng。(c)目标区域扩增用设计的mlh1、msh2、msh6及pms2四个基因的检测panel及ionampliseqtmlibrarykit2.0文库构建等试剂，按照说明书配制扩增体系，设定扩增程序进行pcr扩增反应，富集目标区域。(d)引物消化在pcr反应体系中加入fupa消化液，进行扩增引物消化。(e)连接测序接头按照说明书加入接头及缓冲液，混合均匀后，向体系中加入dna连接酶，为扩增产物添加特定接头。(f)纯化未扩增的文库孵育结束后，使用xpreagent磁珠进行纯化，去除未扩增的dna模板、未反应完的酶、buffer等。(g)文库收集向洗涤并干燥后的磁珠中加入50μllowte溶液，溶解收集文库。(h)文库的质控与定量纯化后的文库进行浓度检测和扩增片段大小检测。使用qubit荧光光度计粗略测定浓度，使用qpcr方法准确测定浓度，文库浓度一般在100pm-500pm之间。用agilent2100生物分析仪检测文库大小分布，文库大小分布要求：片段大小在300bp左右。(i)文库的稀释对质控合格的文库进行合并。根据qpcr定量结果将文库稀释至100pm，等体积合并各个文库；根据测序仪的数据通量、目标区域大小和每个样本所需数据量，计算合并的文库个数。(j)模板扩增与测序芯片点制稀释后的文库在life公司ioncheftm仪上进行乳液pcr、纯化与浓缩。浓缩后的测序微珠由ioncheftm仪进行芯片上样。(k)上机测序将点制后的测序芯片安放到测序仪上，然后按照测序仪的操作说明设定程序进行测序。3.数据分析采用bioelectronseq4000测序仪配套的数据分析系统torrentsuite进行原始数据的处理、分析，检测snp和indel变异。对检测的变异位点使用snpeff软件进行注释，利用clinvar、bic等疾病数据库和其他突变数据库筛选已知的致病变异；利用人群数据库，如dbsnp数据库、千人基因组数据库、esp(外显子组测序数据库)过滤掉已知的中性变异。同时利用正常对照样本的测序结果对剩下的变异进行过滤。选取患者中存在，而正常对照样本中不存在的变异。利用sift、polyphen、mutationtaster等多款预测软件对变异的类型及功能进行预测。其中无义突变(nonsensevariant)、移码突变(frameshift)、选择性剪切变异(splicingvariant)对蛋白结构影响较大，需尤其关注。分析发现3例患癌的家系样本均存在msh6基因的c.586delt杂合突变。使用sanger测序证实了该突变的存在，且在20例正常对照样本和2例未患癌症的家系样本中证实该突变不存在。4.实验结果通过mlh1、msh2、msh6及pms2基因的靶向重测序及生物信息分析，发现林奇综合征家系的三名癌症患者均存在msh6基因c.586delt杂合突变。通过家系内共分离实验及患者的临床表现与基因突变相关疾病的表型信息证明，msh6基因上c.586delt的杂合突变与遗传性肿瘤综合征-林奇综合征的发生有关。编码突变的msh6蛋白的核苷酸序列如seqidno.:3所示核苷酸序列。野生型msh6基因cdna编码区序列见seqidno:4所示核苷酸序列。与编码野生型msh6蛋白的核苷酸序列相比，编码突变的msh6蛋白的核苷酸序列的第586位发生了t核苷酸的缺失。突变的msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno.:1所示。野生型msh6蛋白的氨基酸序列如seqidno.:2所示。突变的msh6蛋白从195位缬氨酸(val)后发生了移码突变，编码蛋白终止于第210位。突变型msh6基因编码的蛋白质(该蛋白质为msh6发生p.cys196valfster15突变得到的蛋白质，该蛋白质由序列3编码)氨基酸序列(序列表中序列1)，其中1至195位氨基酸与野生型msh6相同的序列。实施例2与林奇综合征相关的基因突变的sanger测序验证分别对三个样本中检测到的突变进行sanger测序验证。具体方法步骤如下：(1)基因组dna提取对检测到msh6基因c.586delt突变的样本，采用qiagenminikit从外周血中提取基因组dna。对提取的基因组dna进行质量控制，od260/280在1.8～2.0之间，od260/230在1.8～2.0之间。(2)引物设计及pcr反应参考人类基因组序列数据库grch37/hg19，采用primer3.0针对msh6基因的c.586delt突变位点设计特异性引物，引物序列见表2：表2msh6基因的c.586delt突变的特异性引物(3)pcr反应体系按表3向pcr管中加入各组分，反应总体积20μl。表3pcr反应体系试剂体积/每个反应10×pcrbuffer(mg2+plus)2μldntpmixture(each10mm)0.4μltakarataq(5u/μl)0.1μl正向引物0.4μl反向引物0.4μl基因组dna100ngddh2oupto20μl(4)pcr热循环条件将pcr管短暂离心，然后于pcr仪上按照表4中的热循环条件进行扩增反应。表4pcr扩增程序(5)sanger测序将pcr产物进行测序，结果见图2。图2中a为林奇综合征家系中患癌成员msh6基因第3个外显子发生c.586delt的杂合突变峰，箭头指示的位置为突变位点；b为林奇综合征家系中未患癌成员第3个外显子586位点野生型测序峰；c为msh6基因发生c.586delt突变，导致读码框发生移码。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12