一株能使重金属沉降的硫酸盐还原菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一株能使重金属沉降的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)及其在去除水体中重金属离子中的应用。该菌已于2015年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，电话：(027)68754052，传真：(027)68754833，e-mail：cctcc@whu.edu.cn，其保藏号为cctccno：m2015243。
背景技术：
：硫酸盐还原菌srb(sulfate-reducingbacteria.srb)是自然界中广泛存在的一类原核微生物，它们以硫酸盐为电子受体，消耗有机酸，生成高反应性的硫化物，srb法是利用自然界硫循环原理处理酸性矿山废水(amd)，该方法通过微生物的代谢特性，达到还原so42-、提高废水ph及去除重金属的目的。随着社会经济的高速发展，我国的工业化程度得到极大提高，但伴随着经济发展而出现的环境问题也日益严重。目前城市生活污水处理已在工艺上取得成熟技术并得到应用，但工业废水特别是含高浓度硫酸盐和重金属离子的废水处理仍是令人困惑的技术难题。目前对待只含硫酸盐而不含cod的废水主要采取非破坏性技术，如化学沉淀、电渗析、但这些方法很不经济，还容易产生二次污染。硫酸盐还原菌可用于解决这一类废水的处理问题。硫酸盐还原菌是一类厌氧异养细菌，其生命力很强，广泛存在于土壤、河水、海水等由微生物分解作用造成的厌氧水陆环境中。srb是一类形态、营养多样化的细菌，以有机物作为生化代谢的能量来源和电子供体，通过异化作用以硫酸盐为电子受体将其还原。利用这一特性，将其广泛应用于含硫酸盐的废水和含重金属离子废水等方面的处理。王方等研究了硫酸盐还原菌对酸性废水中重金属的生物沉淀作用，得出结果表明硫酸盐还原菌对zn2+、cu2+、cd2+离子初始含量分别为60mg/l、40mg/l、10mg/l时zn2+、cu2+的沉淀率为99％，cd2+的沉淀率为94％。王辉等做了混合硫酸盐还原菌及其处理重金属废水的研究结果表明，cd2+离子初始含量大于10mg/l时，反应终点时的去除率不足90％。在这些研究中，普遍存在硫酸盐还原菌对一些常见的重金属离子处理能力较差的情况。针对现阶段面临的矿山重金属污染问题，亟需一株具有高效处理常见的重金属离子处理能力的硫酸盐还原菌。技术实现要素：本发明涉及一株能高效沉降重金属离子的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)，该菌株分离自水稻田。现已于2015年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是cctccno：m2015243，名称为硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)。本发明所述的一株能使重金属沉降的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)的培养方法如下：液体培养：把菌种接种于装有液体培养基的培养管中(乳酸钠2.7ml、nh4cl1g、na2so41g、mgso4·7h2o0.1g、k2hpo40.5g、fe(nh4)2(so4)·7h2o0.65g、cacl20.1g、抗坏血酸0.5g、h2o1000ml、ph7.0)将培养基加满，排除多余空气，在35℃-37℃静置培养7天后，培养基呈现黑色，打开瓶盖，有臭鸡蛋气味。固体培养：把菌种涂布接种于固体培养平板中(固体培养基：乳酸钠2.7ml、nh4cl1g、na2so41g、mgso4·7h2o0.1g、k2hpo40.5g、fe(nh4)2(so4)·7h2o0.65g、cacl20.1g、抗坏血酸0.5g、2％琼脂、h2o1000ml、ph7.0)，将接种后的固体培养平板放置在厌氧罐内，在罐中放入微需氧产气袋，然后迅速将厌氧罐盖子盖紧，在35℃-37℃静置培养7天后，在培养基上的srb菌落呈现黑色，并有臭鸡蛋气味。本发明所述的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)的特征如下：(1)形态特征：菌体为杆状或弧状，菌体长度约为1.5-3.5um，革兰氏染色阴性菌。(2)培养特征：该菌株在双层平板培养基或单层微需氧平板培养基上37℃培养7天后，出现乳白色圆形菌落，直径约1-2mm，菌落表面光滑湿润，在加入fe2+的培养基中，菌落呈现黑色。在双层平板培养基中，菌落包埋于培养基中，单层微需氧平板培养基上菌落在培养基表面。(3)菌株的生理生化特征：菌株可利用so42-作为最终电子受体，将有机物作为细胞合成的碳源和电子供体，同时将so42-还原为含硫化合物。硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)能够还原硫酸盐代谢产生h2s，而h2s与铅、锌、钴、铜等许多重金属作用而生成硫化铅、硫化锌、硫化钴、硫化铜而将其除去。硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)为兼性厌氧菌，其生长需氧量为5％-10％，最适生长ph为7，最适生长温度为37℃。(4)遗传学特征：扩增与测序引物：菌液pcr体系：硫酸盐还原菌srb-ldna:2.5μl10xbuffer:5μldntp:4μltlhj-f:0.25μltlhj-r:0.25μltaq:0.5μlddh2o:37.5μl模版加样量2μl，上样模版量1.1μl正向引物：tlhj-f5’—agagtttgatcctggctcaga—3’反向引物：tlhj-r5’—caacttcatgcagtcgagttg—3’提取硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)的总dna，用引物tlhj-f和tlhj-r进行pcr扩增该菌株的16srdna基因，用引物tlhj-f和tlhj-r进行测序，该菌株的16srdna基因序列如seqidno：1所示。在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上，用blast软件将硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)的16srdna基因序列与genbank的已知序列进行比较。结果表明硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)与脱硫弧状菌属(desulfovibriosp.f116sribosomalrnagene,partialsequence)的序列同源性达到99％，证明所述硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)属于脱硫弧菌属。本发明所述硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)具有良好的重金属沉降性能。具有用于土壤及废水中重金属离子去除的能力。10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天后对40mg/l重金属离子cu2+的沉降率达到98％，对10mg/l重金属离子ni2+的沉降率达到61.95％，对250mg/l重金属离子fe2+的沉降率达到96.9％，对70mg/l重金属离子cd2+的沉降率达到78.9％，对70mg/l重金属离子zn2+的沉降率达到97.9％。硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对于cu2+、ni2+、fe2+、cd2+以及zn2+具有较高得沉淀效率，明显优于现有文献报道的硫酸盐还原菌，能够用于处理高浓度重金属离子的水体和土壤。附图说明图1硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)革兰氏染色图片图2硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)电镜图片:电镜型号：s-3400；电压：5.00kv；放大倍数：13.3mm×7.00kse；标尺：5.00μm具体实施方式：实施例1从土壤、废水、水稻田中富集硫酸盐还原菌(1)样本的采集：采集土壤样本时，先将表面土壤挖开，弃去上层表面土壤，在土壤表面5cm以下采集土壤样本，将采集的土壤样本装入自封袋，排除自封袋中的空气，以保证硫酸盐还原菌所需的厌氧环境。采集废水及水稻田中的样本时，在废水及水稻田底部采集样本，最好将废水及水稻田底部的水-泥混合物一起采集，然后装入有盖的瓶子，将样品装满，以排尽瓶内空气，保证硫酸盐还原菌所需厌氧状态。(2)样本的富集：将采集回来的样本处理后，取少许，放入srb液体培养基中，富集菌体，7-8天后，液体培养基颜色变黑，打开盖子后有臭鸡蛋气味，则说明菌体富集成功。(3)菌体培养：将富集成功的菌液，用无菌水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5个浓度，涂布平板，放置在厌氧罐内，在罐中放入微需氧产气袋，然后迅速将厌氧罐盖子盖紧，在35℃-37℃静置培养7天后，在培养基上的srb菌落呈现黑色，并有臭鸡蛋气味。(4)挑去单菌落：将经过菌落挑取后在液体培养基中生长的菌液，用无菌水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5个浓度，采用固体培养基平板涂布，放置在厌氧罐内，在罐中放入微需氧产气袋，然后迅速将厌氧罐盖子盖紧，在35℃-37℃静置培养7天后，在培养基上的srb菌落呈现黑色，并有臭鸡蛋气味。将颜色变黑的菌落挑取，放入液体培养基中，固-液交替培养。(5)纯化：将经过固-液交替培养后在液体培养基中生长的菌液，用无菌水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5个浓度，采用固体培养基平板划线，放置在厌氧罐内，在罐中放入微需氧产气袋，然后迅速将厌氧罐盖子盖紧，在35-37℃静置培养7天后，在培养基上的srb菌落呈现黑色，并有臭鸡蛋气味。将颜色变黑的单菌落挑取。(6)保藏：纯化的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)用甘油-80℃保藏。实施例2硫酸盐还原菌的特征鉴定(1)菌体形态观察和染色反应：将硫酸盐还原菌接种与固体培养基恒温培养适合时间后，染色镜检。染色与镜检结果：硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)为弧状(杆状)细菌，革兰氏阴性，菌体长度约为1.5-3.5μm。(2)采用16srdna比对分析鉴定硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)：扩增与测序引物：正向引物：tlhj-f5’—agagtttgatcctggctcaga—3’反向引物：tlhj-r5’—caacttcatgcagtcgagttg—3’提取硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌株的总dna，用引物tlhj-f和tlhj-r进行pcr扩增该菌株的16srdna基因，用引物tlhj-f和tlhj-r进行测序，该菌株的16srdna基因序列如seqidno：1所示。在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上，用blast软件将硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)的16srdna基因序列与genbank的已知序列进行比较。结果表明硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)与脱硫弧状菌属f1菌株(desulfovibriosp.f116sribosomalrnagene,partialsequence)的序列同源性达到99％，硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)属于脱硫弧菌属。实施例3硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属离子的沉降性能(1)硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属离子cu2+的沉降性能配置硫酸铜母液，按照20mg/l，30mg/l,40mg/l浓度加入10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天。原子吸收测定上清液中cu2+含量。对cu2+的原子吸收测定10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天后对40mg/l重金属离子cu2+的沉降率达到98％。相比于徐建平等做的响应曲面法优化硫酸盐还原菌处理重金属离子条件研究中公开的cu2最优条件最大去除率96.62％略高。(2)硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属离子ni2+的沉降性能配置硫酸镍母液，按照2mg/l，4mg/l,6mg/l,8mg/l,10mg/l,浓度加入10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天。原子吸收测定上清液中ni2+含量。对ni2+的原子吸收测定10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天后对10mg/l重金属离子ni2+的沉降率达到61.95％。(3)硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属离子fe2+的沉降性能配置硫酸亚铁母液，按照150mg/l，200mg/l,250mg/l浓度分别加入10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液。原子吸收测定上清液中fe2+含量。对fe2+的原子吸收测定10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天后对250mg/l重金属离子fe2+的沉降率达到96.9％。(4)硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属离子cd2+的沉降性能配制硫酸镉母液，按照30mg/l，50mg/l，70mg/l浓度分别加入10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天。原子吸收测定上清液中cd2+含量。对cd2+的原子吸收测定10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天后对70mg/l重金属离子cd2+的沉降率达到78.9％。与文献中的报道的王辉等做的混合硫酸盐还原菌及其处理重金属废水的研究相比，本发明公开的srb-l菌具有更为显著地重金属离子的去除效率，本发明公开的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属的处理能力也显著高于已报道的混合硫酸盐还原菌及其处理重金属废水的研究文献中的菌株的处理能力。(5)硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属离子zn2+的沉降性能配制硫酸锌母液，按照30mg/l，50mg/l，70mg/l浓度分别加入10％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天。原子吸收测定上清液中zn2+含量。对zn2+的原子吸收测定样品初始浓度-zn2+(mg/l)沉淀后浓度-zn2+(mg/l)离子去除率(％)srb-l301.2495.8srb-l501.7896.4srb-l701.4497.910％的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)菌液，培养7天后对70mg/l重金属离子zn2+的沉降率达到97.9％。与文献报道的黄志等做的硫酸盐还原茵处理重金属离子的研究相比，本发明公开的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)具有更为显著地重金属离子的去除效率，本发明公开的硫酸盐还原菌srb-l(desulfovibriosp.srb-l)对重金属的耐受能力也显著高于黄志等做的硫酸盐还原菌处理重金属离子的研究文献中的菌株的耐受能力。综合上述实验结果可知，硫酸盐还原菌srb-l对于cu2+、ni2+、fe2+、cd2+以及zn2+具有较高的沉淀效率，明显优于现有文献报道的硫酸盐还原菌，能够用于处理高浓度重金属离子的水体和土壤。当前第1页12