本发明涉及病毒的分子检测方法，具体涉及一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物组、试剂盒及方法。
背景技术：
2013年3月，中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件，由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道，因此出现了一系列亟待解决的问题，引起了全世界范围的广泛关注。截止目前，全国已有20多个省份发现了H7N9病例，而且病例数和死亡数还在持续增加。虽然从家禽和环境中分离的家禽H7N9流感病毒对家禽无致病力，但存在变异成高致病性毒株的风险。为加强源头控制，及时发现、逐步剔除H7N9流感病毒，切实保障畜禽产品安全和公共卫生安全，农业部组织实施了《全国家禽H7N9流感剔除计划》。因此，建立H7N9流感病毒的快速检测方法十分必要。
H7N9禽流感病毒传统的检测方法，是采取病毒分离培养后，结合血凝和血凝抑制方法做出确诊（Wang Wenbo，Peng Haoran，Tao Qingyuan，et a1．Serologic assay for avian-origin influenza A (H7N9) virus in adults of Shanghai，Guangzhou and Yunnan，China[J]J Clin Virol，2014，60(3)：305—308．），但该方法全国只有指定的有限实验室可以开展，且存在费时费力的缺点，难以推广。鉴于此，国家相关部门建议采用核酸检测方法对其进行检测，核酸检测主要采用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR技术。常规RT-PCR方法需要针对HA基因和NA基因分别扩增，跑胶鉴定，或配合基因测序，检测费时费力。近年来，科研工作者陆续建立了系列荧光定量方法（陈奕磊，等，一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物及方法[P]. 浙江：CN104388589A,2015-03-04；陈奕磊，等，一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒[P]. 浙江：CN103233082A,2013-08-07；谢芝勋，等，H7N9禽流感病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒[P]. 广西：CN103255236A,2013-08-21；李兰娟，等，一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒[P]. 浙江：CN103275862A,2013-09-04；罗思思，等，H7N9亚型AIV双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 动物医学进展,2013,12:1-5.），该方法虽然特异性、灵敏度较高，但需要用到至少两条荧光标记探针，检测成本较高。所以建立一种特异性和灵敏度较高，且成本较低的快速检测方法具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测引物组。
本发明的目的之二在于提供一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测方法。
本发明的目的之三在于提供一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1：GTTTAGCTTCGGGGCAT（SEQ ID NO：1），
引物P2：CAAATAGTGCACCGCATG（SEQ ID NO：2），
引物P3：AGGGAGRACAATAAGCACA（SEQ ID NO：3），
引物P4：TTTATCCTCCTTGGGTCTY（SEQ ID NO：4）。
一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以提取的核酸为模板，用权利要求1所述的引物P1、P2、P3、P4及荧光饱和染料进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒是否为H7N9禽流感病毒；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
进一步的，步骤2）中RT-PCR扩增反应体系为：
模板RNA 2 µL
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 µL
2×1 Step Buffer 12.5µL
10 mM引物P1 1µL
10 mM引物P2 1µL
10 mM引物P3 1µL
10 mM引物P4 1µL
Syto9 1µL
RNase Free ddH2O 4.5µL
总体积 25µL。
进一步的，步骤2）中的RT-PCR扩增反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s；循环35次。
进一步的，步骤3）中的HRM分析程序为：98℃变性2min，40℃杂合2min，74℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
进一步的，步骤3）中所述HRM分析的具体分析过程为：以H7N9阳性对照品作参考，若样品只形成一个熔解峰，且Tm值为77.92±0.25℃，则检测样品中含有H7亚型禽流感病毒；
若样品只形成一个熔解峰，且Tm值为81.92±0.35℃，则检测样品中含N9亚型禽流感病毒；
若样品形成两个熔解峰，且两个熔解峰的Tm值分别为77.92±0.25℃、81.92±0.35℃，则检测样品中含有H7N9禽流感病毒。
本发明的有益效果是：
1）本发明首次建立了一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM检测方法及其引物组，操作简单：只需在PCR反应之前加入荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需2-3小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针，每个样品的饱和染料成本为1.6 RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。
2）本发明两对引物P1、P2、P3、P4对H7N9禽流感病毒均有很好的扩增性，有利于提高本发明对快速鉴定H7N9禽流感病毒分析的扩增效率。
3）本发明的PCR-HRM引物特异性好，引物对P1和P2除可以与H7亚型禽流感病毒结合外，不与其他常见禽源病毒，如新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV）、H5N1、H5N6、H3N2、H9N2、H6N2亚型禽流感病毒等核酸结合，仅特异性扩增H7亚型禽流感病毒核酸；引物对P3和P4除可以与N9亚型禽流感病毒结合外，不与其他常见禽源病毒，如新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV）、H5N1、H5N6、H3N2、H9N2、H6N2亚型禽流感病毒等核酸结合，仅特异性扩增N9亚型禽流感病毒核酸；而两对引物P1和P2、P3和P4除可以与H7N9禽流感病毒结合外，不与其他常见禽源病毒，如新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV）、H5N1、H5N6、H3N2、H9N2、H6N2亚型禽流感病毒等核酸结合，仅特异性扩增H7N9亚型禽流感病毒核酸，有利于提高本发明对快速鉴定H7N9禽流感病毒分析的正确性。
4）本发明利用HRM方法对扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，对H7亚型禽流感病毒、N9亚型禽流感病毒、H7N9禽流感病毒分别形成特异的熔解峰型的方法来提高病毒鉴定的准确性和重复性。
附图说明
图1 为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法峰型化熔解曲线图；
图2 为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法临床检测样本峰型化熔解曲线图，SC1-20为临床采集的疑似流感病毒检测样品，已经过经典方法确定过内含病原；
图3 为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法特异性实验峰型化熔解曲线图；
图4 为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法标准阳性样本灵敏度试验扩增曲线图（I）和峰型化熔解曲线图（II），A为H7N9标准样本提取核酸为模板进行RT-PCR-HRM熔解曲线分析，B-H为将A提取核酸后做梯度稀释（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7）后进行RT-PCR-HRM熔解曲线分析；
图5 为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法阳性质粒灵敏度试验结果，HA基因阳性质粒峰型化熔解曲线图（I）和NA基因阳性质粒峰型化熔解曲线图（II），A-F为阳性质粒梯度稀释（1x105copies/μl，1x104copies/μl，1x103copies/μl，1x102copies/μl，1x101copies/μl，1x100copies/μl，）后进行RT-PCR-HRM熔解曲线分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物
本发明快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物，其核苷酸序列如下所示：
P1：GTTTAGCTTCGGGGCAT（SEQ ID NO：1），
P2：CAAATAGTGCACCGCATG（SEQ ID NO：2）；
P3：AGGGAGRACAATAAGCACA（SEQ ID NO：3），
P4：TTTATCCTCCTTGGGTCTY（SEQ ID NO：4）。
实施例2一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的方法
阳性样品的PCR-HRM分析
1）H7N9阳性样品核酸的提取：
准备好收集的H7N9病毒的鸡胚尿囊液，取该样品200μL，并按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行样品中核酸的提取。
2）H7N9阳性样品的RT-PCR- HRM操作步骤
为了验证所设计的引物组对实际样品的鉴别能力，本研究利用经鸡胚传代分离病毒，并通过血凝与血凝抑制试验鉴定过的H7N9病毒作为标准样品进行RT-PCR-HRM分析。以上述标准样品提取核酸作为核酸模板，进行RT-PCR-HRM扩增反应和分析。
RT-PCR扩增和HRM分析
参照PrimeScript® One Step RT-PCR Kit产品说明书，按以下组成配制RT-PCR反应液。引物组P1、P2、P3、P4为鉴定H7N9禽流感病毒的扩增引物：
PCR反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s；循环35次；
HRM运行程序：98℃变性2min，40℃杂合2min，74℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
HRM试验结果用LightCycler® 96 SW 1.1软件进行分析。
3）阳性样品PCR-HRM结果分析
RT-PCR扩增产物用ROCHE LightCycler 96分析仪进行分析。H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析峰型化熔解曲线分析结果如图1所示。
图1为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法峰型化熔解曲线图。分析结果显示，本发明RT-PCR-HRM分析方法能够鉴定H7N9禽流感病毒。对扩增产物进行熔解曲线分析，针对H7N9禽流感病毒形成双峰，熔解峰1形成的Tm值为77.92±0.25℃℃，熔解峰2形成的Tm值为81.92±0.35℃。
实施例3一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的方法
临床样品RT-PCR-HRM分析
1）从样本中提取病毒核酸：分别取疑似感染禽流感病毒病死禽气管、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏和脑等组织样品2g，加入3mL PBS盐酸缓冲溶液进行研磨，将研磨好的匀浆液4000×g 离心 8 min，并吸取离心上清液至-80℃保存备用。或取活禽气管或泄殖腔式子或粪便，加入到1mlPBS中，式子样本反复捻动，挤干后弃去式子。取组织样品匀浆液或式子样本或粪便沉淀或鸡胚尿囊液上清200μL按TAKARA的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0的说明书进行核酸提取。
2）以提取的病毒核酸为模板，进行RT-PCR-HRM扩增（参照PrimeScript® One Step RT-PCR Kit试剂盒说明书），扩增反应体系为：
PCR反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s；循环35次；
HRM运行程序：98℃变性2min，40℃杂合2min，74℃到85℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
HRM试验结果用LightCycler® 96 SW 1.1软件进行分析。
3）对扩增产物进行HRM分析（用LightCycler® 96 SW 1.1软件进行分析），确定病毒为H7N9禽流感病毒，具体分析过程为：
以阳性对照品H7N9为参考，形成双峰，熔解峰1形成的Tm值为77.92±0.25℃，熔解峰2形成的Tm值为81.92±0.35℃，临床检测样品如果只形成熔解峰1，Tm值为77.92±0.25℃，则检测样本为H7亚型禽流感病毒；临床检测样品如果只形成熔解峰2，Tm值为81.92±0.35℃，则检测样本为N9亚型禽流感病毒；临床检测样品如果形成双峰，熔解峰1的Tm值为77.92±0.25℃，熔解峰2的Tm值为81.92±0.35℃，则检测样本为H7N9禽流感病毒。
为了验证所建立的方法对实际临床样品的鉴别能力。本发明对广东某高校提供的临床检测样本20份（已经过经典方法确定过内含病原），进行检测，结果如图2，根据以上判定标准，有7份样本为H7N9亚型禽流感病毒阳性（即图2中所示的样本SC3、SC4、SC11、SC13、SC14、SC15和SC16），该结果与通过病毒分离，血凝和血凝抑制试验结果一致。
实施例4 一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的方法
特异性实验
下面对本发明建立的鉴定H7N9禽流感病毒的方法进行特异性检测。
分别提取其他常见禽病毒核酸，如NDV，IBV，H5N1、H5N6、H3N2、H9N2、H6N2亚型禽流感病毒的核酸为模板，以上述实施例3中所述的方法进行HRM分析，分别验证引物对P1/P2、P3/P4特异性，同时以H7N9的标准样品为阳性对照，水作为阴性对照进行RT-PCR-HRM分析。
分析结果如图3所示，从图上可看出，本发明HRM检测方法能形成H7N9特异熔解双峰，而其它常见病毒，如新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV）、H5N1、H5N6、H3N2、H9N2、H6N2亚型禽流感病毒样品均未形成H7N9特异熔解双峰，表明本发明使用的引物对P1/P2和P3/P4特异性高，适合作为HRM分析引物。
实施例5一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的方法
灵敏度试验
（1）对阳性H7N9禽流感病毒核酸的灵敏度检测
下面对本发明建立的鉴定H7N9禽流感病毒的方法进行灵敏度检测。
以H7N9标准样本提取核酸为模板，梯度稀释（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7）后进行RT-PCR-HRM分析，确定该HRM方法最低检测限。用上述实施例2中所述的RT-PCR-HRM方法进行灵敏度试验。
图4为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法标准阳性样本灵敏度试验扩增曲线图（I）和峰型化熔解曲线图（II），A为H7N9标准样本提取核酸为模板进行RT-PCR-HRM熔解曲线分析，B-H为将A提取核酸后做梯度稀释（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7）后进行RT-PCR-HRM熔解曲线分析。从图上可看出，本发明快速鉴定H7N9禽流感病毒核酸的HRM分析法对H7N9核酸的最低检测稀释度为10-5。
（2）对含H7N9禽流感病毒核酸的阳性质粒的灵敏度检测
以H7N9标准样本提取核酸为模板，以引物对79HT-F：5’-ATGAACACTCAAATTT TGGCACTC-3’（SEQ ID NO：5），79HT-R：5’-WTATATACAAATAGTGCACCGCATG-3’（SEQ ID NO：6）进行PCR扩增，将扩增产物，跑胶，回收，与PMD18T-vector载体连接转化，构建阳性质粒pH7；另外，再用引物对79NT-F：5’-ATGAATCCAAATCAGAAGATTC-3’ （SEQ ID NO：7），79NT-R：5’-TTAGAGGAAGTACTCTATTTTAGCC-3’（SEQ ID NO：8）对H7N9核酸进行扩增，将扩增产物，跑胶，回收，与PMD18T-vector载体连接转化，构建阳性质粒pN7。分别测定质粒pH7和pN7的核酸浓度，分别调节初始浓度A为1x105copies/μl，依次做10倍梯度稀释，B：1x104copies/μl；C：1x103copies/μl；D：1x102copies/μl；E：1x101copies/μl；F：1x100copies/μl。分别确定本发明HRM方法对阳性质粒pH7和pN7的最低检测限。用上述实例2中所述的RT-PCR-HRM方法配制反应体系， PCR反应程序调整为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸15s；循环35次；其它不变。
图5 为H7N9禽流感病毒RT-PCR-HRM分析方法阳性质粒灵敏度试验结果，pH7阳性质粒峰型化熔解曲线图（图5 I）和pN7阳性质粒峰型化熔解曲线图（图5 II）。从图上可看出，本发明快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM分析法对pH7阳性质粒最底检测限为1x101copies/ul，对pN7阳性质粒最底检测限为1x100copies/ul。
综合以上结果，本发明快速鉴定H7N9禽流感病毒的HRM分析法对H7N9禽流感样本最低检测限可达1x101copies/ul。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速鉴定H7N9禽流感病毒的引物组、试剂盒及方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
gtttagcttc ggggcat 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
caaatagtgc accgcatg 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
agggagraca ataagcaca 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
tttatcctcc ttgggtcty 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
atgaacactc aaattttggc actc 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
wtatatacaa atagtgcacc gcatg 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
atgaatccaa atcagaagat tc 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
ttagaggaag tactctattt tagcc 25