技术领域本发明属于禽类育种技术领域。更具体地，涉及鸡GnRHR-2基因在作为鸡繁殖性状的分子标记方面的应用。
背景技术：
禽类繁殖性状可根据实际育种需要进行适当的细分，如开产日龄、开产蛋重、总产蛋数、就巢率和就巢持续天数等，而总产蛋数又可进一步细分为总的合格蛋数、双黄蛋数、畸形蛋数等。目前，我国绝大部分的地方鸡种年产蛋量只有70~90枚，具有顽固的就巢性（Yangetal.，2005），如泰和丝羽乌骨鸡、杏花鸡等，繁殖性能较低，是制约优质鸡产业进一步发展的瓶颈。因此，提高优质鸡的繁殖性能是优质肉鸡和优质蛋鸡的共同需要，是优质鸡育种工作中需要重点解决的问题。鸡繁殖性状是一个复杂性状，具有遗传力低，易受环境影响等特点，受下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamus-Pituitary-Gonadal-Axes，HPG）的高度调控，促性腺激素释放激素（Gonadotrophinreleasinghormone，GnRH）被认为是生殖激素的中枢调节器（Millar，2005）。GnRH是由下丘脑分泌产生的神经激素。下丘脑在光照的刺激下释放GnRH，通过垂体门脉，刺激促性腺激素（gonadotropinhormone，GtH）合成与分泌，同时作用于卵巢，调节卵巢卵泡的生长发育并产生甾体激素，促使卵泡颗粒细胞合成孕酮并使鸡的卵泡膜大量增多，通过诱导排卵来提高鸡的产蛋量。但是，由于GnRH是大分子物质不能通过细胞膜，只能通过与其膜上的受体（gonadotropinreleasinghormonereceptor，GnRHR）结合从而发挥其生物学作用，所以GnRHR对动物的生殖也有极其重要的影响。GnRHR是具有7次跨膜结构的膜蛋白，属于G蛋白偶联受体家族（G-protein-coupledreceptorfamily，GPCR）（Papageorgiou等，2005），与G蛋白（Gq）和磷脂酶（phospholipase）偶联。垂体促性腺细胞质膜上的促性腺激素释放激素受体与GnRH结合后，一系列细胞内信号通路被激活从而调节和表达各种生物学功能（肖杰文等，2008）。而在禽类上，鸡GnRHR家族已经鉴定出2种类型，鸡GnRHR-1基因在下丘脑、垂体等性腺组织和非性腺组织中广泛表达（Sun等，2001），该基因位于10号染色体（+）链上，大小为1,482bp，包括4个外显子和3个内含子；GnRHR-2基因主要在垂体中表达（Joseph等，2006；Shimizu等，2006；张涛等，2014），位于10号染色体（-）链，大小为2,309bp，包括4个外显子和3个内含子。目前已经发表的GnRHR基因多态位点与鸡繁殖性能相关的文献全部都是关于GnRHR-1基因的相关的研究（Wu等，2007；Xu等，2011；詹慧琴，2006；张旭等，2007；徐海平等，2011；朱凯等，2011；徐文娟等，2012）。而关于鸡GnRHR-2基因与鸡繁殖性状之间是否有关系？以及有何种关系？尚未见有相关的研究和报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中鸡繁殖性状的分子标记相关研究的不足，以及优质繁殖性能鸡的选育技术的不足，提供鸡GnRHR-2基因在作为鸡繁殖性状的分子标记方面的应用。具体是提供一个与鸡开产日龄、300日龄产蛋量相关的GnRHR-2基因上的位点，该位点可以作为分子标记，用于选育优质繁殖性能鸡。本发明的另一目的是提供上述与鸡开产日龄、300日龄产蛋量相关的GnRHR-2基因上的位点的应用。本发明上述目的通过以下技术方案实现：鸡GnRHR-2基因在作为鸡繁殖性状的分子标记方面的应用，所述鸡GnRHR-2基因的序列如SEQIDNO.1所示。同时，鸡GnRHR-2基因在选育优质繁殖性能鸡方面的应用，也在本发明的保护范围之内。优选地，上述应用是指鸡GnRHR-2基因上的如SEQIDNO.2所示的基因片段在作为鸡繁殖性状的分子标记方面的应用。同时，鸡GnRHR-2基因上的如SEQIDNO.2所示的基因片段在选育优质繁殖性能鸡方面的应用，也在本发明的保护范围之内。更优选地，所述应用是指鸡的GnRHR-2基因外显子2上第104bp处的一个T→C突变SNP位点在作为鸡繁殖性状的分子标记方面的应用。更进一步地，上述应用是指基于鸡的GnRHR-2基因外显子2上第104bp处的一个T→C突变且产生了一个MspI内切酶位点的PCR-RFLP分型检测来研究该位点的多态性，以此判断鸡繁殖性状。优选地，所述鸡繁殖性状是指鸡开产日龄和/或300日龄产蛋量。具体判断的方法为：当PCR-RFLP分型检测的结果电泳图中，显示299bp的单一片段时为CC基因型个体，显示389bp单一片段时为TT基因型个体，当显示299bp和389bp两条片段时为CT基因型个体。CT基因型个体的开产日龄显著早于CC基因型个体、300日龄总产蛋数极显著高于CC型个体，为优势基因型。一种鸡繁殖性状的分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种鸡繁殖性状的分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。一种鸡繁殖性状的分子标记，所述分子标记为鸡的GnRHR-2基因外显子2上第104bp处的一个T→C突变SNP位点。上述鸡繁殖性状的分子标记（鸡的GnRHR-2基因外显子2上第104bp处的一个T→C突变SNP位点）在选育优质繁殖性能鸡方面的应用，也在本发明的保护范围之内。具体地，所述应用的方法为：（1）以鸡GnRHR-2基因DNA序列（序列如SEQIDNO.1所示）为模板，以引物F2（SEQIDNO.5）和引物R2（SEQIDNO.6）进行PCR扩增；（2）PCR-RFLP分型检测：取6μLPCR扩增产物，加入10UMspI限制性内切酶和1μL10×酶切缓冲液，加水至10μL；反应完成后，用2.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压100V，时间为40min，在凝胶成像系统中观察条带，根据产物的大小判定该位点在检测群体中的基因型；（3）当PCR-RFLP分型检测的结果电泳图中，显示299bp的单一片段时为CC基因型个体，显示389bp单一片段时为TT基因型个体，当显示299bp和389bp两条片段时为CT基因型个体；CT基因型个体的开产日龄显著早于CC基因型个体、300日龄总产蛋数极显著高于CC型个体，为优势基因型。其中，优选地，步骤（1）中PCR反应程序为：94℃变性3min；94℃30sec，58℃1min，72℃1min；35个循环；72℃延伸10min。本发明具有以下有益效果：本标记为鸡繁殖性能，尤其是开产日龄、300日龄总产蛋量的选育，提供了一种新的分子标记。实验证明，GnRHR-2基因对开产日龄、300日龄总产蛋量有一定的影响，可以做为候选基因或开产日龄与300日龄产蛋量的遗传标记。而且，本发明的分子标记应用于鸡繁殖性能，尤其是开产日龄、300日龄总产蛋量的选育时，检测方法简单、快速，有很好的应用前景。附图说明图1为本发明的技术路线图。图2为用鸡血液总DNA扩增GnRHR-2基因的琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道从左至右分别为DNAMarker（100-2000bp）、样本1；琼脂糖凝胶浓度为1.0%；得到1058bp的片段。图3为GnRHR-2基因1058bp测序结果图；箭头指向的是T→C突变位点。图4为用鸡血液总DNA扩增GnRHR-2基因的琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道从左至右分别为DNAMarker（100-2000bp）、样本1-6；得到389bp的片段，琼脂糖凝胶浓度为1.0%。图5为对GnRHR-2基因389bp片段PCR后产物经过MspⅠ酶切的基因分型电泳图，图中泳道从左到右分别为DNAMarker（100-2000bp）、CC基因型个体、CT基因型个体、CC基因型个体、TT基因型个体、CT基因型个体、CT基因型个体。图6为鸡的GnRHR-2基因外显子2上第104bp处的一个T→C突变示意图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1鸡血样的采集和DNA的提取1、对多个鸡样本进行300日龄繁殖性状测定记录。2、300日龄繁殖性状测定完成后，采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL2%无菌EDTA（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-80℃保存备用。3、基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法（参考奥斯泊F等，1998）：（1）取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20%SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；（2）取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；（3）取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10000rpm离心10min；（4）取上清，加入500μL氯仿-异戊醇（23：1）轻摇20min，10000rpm离心10min；（5）取上清，加入1mL冰无水乙醇（-20℃），来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；（6）用1mL75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；（7）待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；（8）存放于-20℃冰箱中保存备用。实施例2SNP的筛选1、根据GeneBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，2015年3月）上所公布鸡GnRHR-2基因mRNA序列（GenBank序列号：NM_001012609）与鸡基因组（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat）比对，得到鸡GnRHR-2基因DNA序列，序列如SEQIDNO.1所示。2、根据该序列设计引物对F1/R1，经Oligo软件检测，确定引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物F1（SEQIDNO.3）：5’ggctgttcacgctcatctctgt3’；引物R1（SEQIDNO.4）：5’caggcgcaggtacatgaggag3’。3、以实施例所得DNA为模板，利用上述引物对F1/R1进行PCR扩增。（1）PCR反应扩增程序如表1所示：表1PCR反应程序（2）用1.0%含EB琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，所述电泳条件为电压100V，时间为20min，在凝胶成像系统中观察条带，如附图2所示，扩增出包含了外显子1、内含子1与部分外显子2的片段，长度为1058bp。电泳条带进行回收和纯化，产物直接测序，发现在外显子2上第104bp处的存在一个T→CSNP位点，且产生了一个MspI酶切位点（如附图3所示）。实施例3待测片段的获得、基因型判定及关联分析1、待测位点片段的获得（1）设计引物对F2/R2，经Oligo软件检测，确定引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物F2（SEQIDNO.5）：5’aggggactagggaaggctgagac3’；引物R2（SEQIDNO.6）：5’gagcacaaagagcacgaaggt3’。（2）以上述DNA为模板，利用上述引物对F2/R2进行PCR扩增。PCR反应扩增程序如表2所示：表2PCR反应程序取2μLPCR扩增产物在1.0%含EB琼脂糖凝胶进行电泳检测，所述电泳条件为电压100V，时间为15min，在凝胶成像系统中观察条带（如附图4所示）。扩增出含有待测位点的核苷酸片段，长度为389bp，序列如SEQIDNO.2所示。2、PCR-RFLP基因型判定取6μL上述PCR扩增产物，加入10UMspI限制性内切酶和1μL10×酶切缓冲液，加水至10μL；反应完成后，用2.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压100V，时间为40min，在凝胶成像系统中观察条带（如附图5所示），根据产物的大小判定该位点在检测群体中的基因型。图5中，泳道从左到右分别为DNAMarker（100-2000bp）、CC基因型个体、CT基因型个体、CC基因型个体、TT基因型个体、CT基因型个体、CT基因型个体。3、关联分析对鸡GnRHR-2基因多态位点不同基因型与鸡繁殖性状进行关联分析的检测应用。鸡GnRHR-2基因MspI酶切多态位点关联分析结果见表3所示。表3GnRHR-2基因T19480755C位点与鸡繁殖性能的关联分析备注：1：最小二乘均值±标准误；（）内数字表示个体数；表中相同字母表示差异不显著，不同大写字母表示差异极显著；*表示显著相关（P<0.05），**表示极显著相关（P<0.01）。AFE：开产日龄；EN300：300日龄总产蛋数。由表中数据可以得出，三种基因型间对鸡开产日龄（AFE）和300日龄产蛋量（EN300）的影响分别达到了显著水平（P<0.05）和极显著水平（P<0.01）。CT基因型个体的开产日龄显著早于CC基因型个体、300日龄总产蛋数极显著高于CC型个体，为优势基因型。综上研究所得，得到与鸡开产日龄、300日龄产蛋量相关的GnRHR-2基因上的位点，该位点位于鸡的GnRHR-2基因外显子2上第104bp处的一个T→C突变（如附图6所示）。而且，不仅GnRHR-2基因外显子2上第104bp处存在1个碱基突变，且产生了一个MspI内切酶位点，我们可以使用PCR-RFLP分型的方法来研究该位点的多态性。SEQUENCELISTING<110>南昌师范学院<120>鸡GnRHR-2基因在作为鸡繁殖性状的分子标记方面的应用<130><160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1058<212>DNA<213>鸡GnRHR-2基因序列<400>1ggctgttcacgctcatctctgtgtgggtgatgcggggtaaaggacggagtcgttccacgc60aggttggctacgtcaaggagcaacctgagctgccaagggcatcccacgggcagcagctgg120cggggcgccgggctagagcggaggtggctgcaggcagcggagcgctgcagtgctggccct180gctgcccgtgtcccgtctggctgcagctggtgccgatgtgggagcgctgggagcagtgag240tgggcggtgtttgagcagccccgacatggcccggctcggcgggggaacagggcaggatgc300tgcagctgcaggtgaggcgtgcagggagatgggtgcagggagcgtggggtgctgcaccaa360ggggctcctgcactggagagtgtctttgtccctgagcaggaggaccacgagggatgttct420ggggcggggtggtcagggcggcagcaatggcctggggta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