八氢蒽类化合物及其制备方法和用途与流程
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一系列八氢蒽类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
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阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)是一种慢性中枢神经系统的退行性疾病，是最常见的老年性痴呆类型。临床早期表现主要为患者记忆力的减退和生活自理能力的下降，最终导致认知功能障碍和缺失、神经行为异常及生活自理能力的完全丧失，病程一般为6～12年，常因并发感染而死亡。2010年国际阿尔茨海默病研究中心(alzheimer’sdiseaseinternational,adi)报告统计全世界约有3560万人患痴呆，约占全球总人口的0.5％，痴呆人数占60岁以上人数的5％～7％，预计2050年痴呆患者数将达到11540万人。2010年全球用于痴呆的治疗费用高达6040亿美元，预测至2030年痴呆的治疗费用开支将会增加85％。而据世界卫生组织推算，到2020年，ad将成为我国疾病负担排名第4位的疾病。ad不仅严重影响患者的身体健康和生活质量，同时也给患者的家庭和社会带来沉重的负担，ad病因病机的阐明和预防治疗手段的研究已成为亟待解决的医学难题和社会难题。
ad的神经病理学特征包括弥漫性脑萎缩、细胞外神经(炎)斑(neuriticplaques)或称老年斑(senileplaques,sp)的沉积、细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillarytangle,nft)及神经元丢失，另外伴有颗粒空泡变性和脑膜的血管淀粉样变性等。
ad的病因和发病机制非常复杂，虽然目前对其研究报道很多，但迄今为止，ad的发病机制尚未完全阐明，这与其发病机制的复杂性和多因素的共同作用有关。对于ad的发病机制存在多种假说，包括胆碱能学说、淀粉样β肽(β-amyloidpeptides,aβ)沉积假说、氧化应激假说、炎症和免疫学说、微管相关蛋白功能异常假说、胰岛素假说、金属离子代谢紊乱假说、基因突变假说等等。
淀粉样蛋白级联假说一直占有ad发病机制的主要地位。该假说认为：脑内淀粉样蛋白前体(amyloidproteinprecursor,app)的异常代谢使得淀粉样β-蛋白产量增多、降解减少，引起aβ大量聚积，过量aβ聚积形成淀粉样斑块(即老年斑，sp)，产生神经毒性。为此，以aβ为靶点的ad治疗药物成为临床研究的主要方向之一。
aβ的产生及代谢
app是aβ前体蛋白。正常情况下，人体内app存在两条水解途径。一条是非aβ生成途径，app主要由α-分泌酶水解成含部分aβ序列的可溶性app(solubleapp,sappα)和c83羧基端片段，后者在γ-分泌酶的作用下进一步降解，目前已知sappα具有神经营养作用，可促进神经细胞发育，并通过降低胞内ca2+浓度，起到神经细胞保护作用，与学习、记忆功能有关，但尚未证明sappα缺乏与ad发病有直接关系。该途径是app代谢的主要途径；另一条是aβ生成途径，app首先经β-分泌酶水解生成sappβ和c99羧基端片段，后者在γ-分泌酶的作用下产生aβ42或aβ40。而aβ42更倾向形成β折叠结构而易于聚集为寡聚体和纤维，较aβ40具有更强的细胞毒性。同时近期的研究证实可溶性的寡聚aβ比成熟的不溶纤维性aβ更具有神经毒性。aβ的毒性机制有很多，比如，aβ可以诱导脑神经元产生氧自由基，使神经细胞膜的结构遭到破坏而功能异常；另外，aβ可能改变神经递质和信号分子的分布；aβ还可以使细胞内游离钙离子增多，通过多种途径引发线粒体功能紊乱、轴浆运输功能障碍、导致神经元丢失等等。但是，也有研究者认为aβ不是死亡的预言者而是神经元损伤的保护性反应。在纳摩尔的生理浓度下，aβ可以作为一种营养因子，具有营养和神经保护作用。zou等证实在纳摩尔浓度下aβ42单体可以作为一种营养性因子抑制金属诱导的氧化应激。也有研究者认为在ad患者中，aβ生成的增加也许是超过了生理浓度，使其获得神经毒性作用。虽然aβ在ad中的作用还比较模糊，但当它的浓度增加到一定程度时，毒性作用大于保护作用。
aβ的代谢主要有两个途径：酶促降解途径及受体介导的转运出脑途径。
为此，靶向aβ产生、聚集和清除等关键环节的药物研发成为研究的热点，以其为靶点的药物主要分为以下几种：
减少aβ的生成
α-分泌酶激动剂
目前对α-分泌酶的研究报道较少。α-分泌酶为解聚素和金属蛋白酶(adisintegrinandmetalloproteinase,adam)家族的一员，上调其活性不仅可以减少aβ的生成，还可以增加具有神经保护作用的sappα生成，具有潜在的ad治疗作用。α-分泌酶的活性受蛋白激酶c(proteinkinasec,pkc)蛋白磷酸化信号传导通路的调控，直接刺激其活性或间接刺激pkc及pkc通路相关蛋白的活性均可实现上调α-分泌酶的活性。研究发现某些他汀类药物、维生素a类药物及神经肽(如垂体腺苷酸环化酶激活肽)等可增加α-分泌酶或pkc活性。
β-分泌酶抑制剂
目前认为有两种不同的β-分泌酶，bace1(β-siteapp-cleavingenzyme1)及bace2。bace1具有β-分泌酶的所有活性，为aβ产生的关键酶。bace2为bace1的同源酶，主要分布在心脏、肾脏和胎盘，但在脑组织中很少，可与bace1竞争app位点，但不能催化形成完整的aβ，因此可推断bace2在aβ的产生中不占重要位置。因此选择性的bace1抑制剂有潜在的ad治疗作用，但存在两大制约因素：首先，bace1有非常重要的生理作用，抑制其活性可能会产生明显的毒副作用；另外，bace1的活性区域较大，抑制其活性所需的化合物体积较大，而大体积化合物很难通过血脑屏障。正是由于这些制约因素，在众多bace1抑制物中，只有少数化合物进入了临床试验。
γ-分泌酶抑制剂
γ-分泌酶作为直接催化产生aβ的关键酶，抑制其活性是治疗ad的极具诱惑性的靶点。研究发现，γ-分泌酶除作用于app相关底物外，还可通过notch信号转导通路等影响胚胎发育、造血、细胞粘附、细胞间相互作用等多种生理功能，非特异性地抑制其活性可产生许多明显而严重的副作用。目前研究的重点主要是寻找高选择性的γ-分泌酶抑制剂或调节剂。另外，一些非甾体类抗炎药物(如布洛芬、吲哚美辛及硫化舒林酸、氟比洛芬等)均具备γ-分泌酶调节剂的作用。其中，氟比洛芬(也叫tarenflurbil或mpc-7869)的ⅱ期临床试验结果喜人，然而，在其iii期临床试验试验中却得到了完全阴性的结果。分析原因可能与tarenflurbil的抑制γ-分泌酶活性有限及血脑屏障通透性较差有关。
抑制aβ聚集类药物
aβ聚集是一个多步骤的过程，涉及多个中间体，包括寡聚体和原纤维。tramiprosate是一种多糖类似物，可与aβ结合阻抑斑块的形成。ⅱ期临床试验结果显示，长期使用tramiprosate的安全性良好，并可以减少脑脊液中的aβ42。但其在ⅲ期临床试验中未显示出明显效果，已被停止试验。
另外，研究发现大脑内的锌离子、铜离子等金属离子可促进可溶性aβ的聚合并稳定aβ聚合物。pbt1(clioquinol)为一种可影响铜、锌离子与aβ相互作用的金属络合剂，ⅱ期临床试验发现其耐受性良好，可有效降低血浆aβ浓度并减轻ad患者的认知恶化(尤其在重度ad患者中)。然而，由于制造工艺的问题，pbt1中总是夹杂一些高毒性杂质，限制了其进一步应用。pbt2为pbt1的类似物，在动物实验中显示出与pbt1相同或更优的抗aβ寡聚作用，目前也进入了ⅱ期临床试验，发现pbt2的安全性及耐受性良好，可有效降低脑脊液中的aβ1-42浓度并对ad患者的两项执行功能有一定的改善作用。
促进aβ的清除
主要包括增加aβ的酶促降解和上调受体介导的aβ转运出脑两种途径
维甲酸类化合物在ad治疗中的应用
受体亚型选择性维甲酸类化合物具有较好的靶向性并可降低维甲酸类化合物的毒副作用，因而是维甲酸类化合物的主要研究方向之一。目前已上市的受体亚型选择性药物包括他米巴罗汀和贝沙罗汀。研究报道贝沙罗汀可以迅速清除实验阿尔茨海默氏症状样疾病小鼠脑内沉积的β淀粉样蛋白，被认为对老年性痴呆疾病的治疗具有巨大潜力(science,2012,335(6075):1503-1506.)。
技术实现要素：
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本发明提供了一些高效、极低毒的促进aβ淀粉样斑块的清除和减少aβ淀粉样斑块沉积的八氢蒽类化合物。生物活性实验发现该类化合物连续口服给药7-15天即能显著改善8月龄app/ps1双转基因ad模型小鼠空间学习记忆、形象辨别记忆及长期学习记忆障碍，并可使各种学习记忆成绩回复至正常对照组水平，app/ps1双转基因ad模型小鼠大脑皮层及海马β淀粉样蛋白沉积实验发现该类化合物能促进aβ淀粉样斑块的清除和减少aβ淀粉样斑块沉积，其清除率可达67％左右，安全性初步评价：给小鼠灌胃化合物oab-145000mg/kg，即药效剂量的30倍，未见小鼠肉眼可见的不良反应，小鼠状态良好。以多奈哌齐做阳性对照药，8月龄app/ps1双转基因ad模型小鼠，结果显示，不论是连续14天给药，还是连续3个月给药，oab-14均能剂量依赖性地改善模型动物在新物体辨别实验、y-迷宫实验、morris水迷宫实验、筑巢实验及社交活动实验中多种学习记忆障碍，提高认知功能、社会交往及生活自理能力，呈良好的量效关系，尤其是高剂量组明显强于多奈哌齐组，完全恢复到空白组水平，且主要脏器组织切片与空白组比较未见任何改变。在改善学习记忆，减少β淀粉样蛋白沉积的同时，心、肝、脾、肾等脏器指数未见异常。因此，该类化合物可用于神经退行性疾病(如阿尔兹海默症、帕金森氏病等)、肿瘤等的治疗。
本发明的化合物结构式如(ⅰ)或(ii)所示：
其中，x为h、c1-c6烷基；
linker为取代或未取代的c6-c10芳酰(磺酰)基或杂芳酰(磺酰)基，所述取代基为c1-c6烷基，c1-c6烷氧基，卤素，氨基，硝基，巯基，硫醚，砜，亚砜，胺基烷氧基。
r1为氢或c1-c6烷基；
r为含氮或不含氮的结构片段；
r2,r3可为氢，含氮或不含氮的结构片段，
所述不含氮的结构片段为c1-c20烷基；
所述含氮的片段结构为：
linker1为c2-c6直链或支链烷基，nr4r5为一级胺或二级胺。
本发明优选具有如下结构的化合物：
其中，x为h、c1-c6烷基；
linker为取代或未取代的苯基、吡啶、呋喃、吡咯、噻唑或噻吩，所述取代基为c1-c6烷基，c1-c6烷氧基。
r1为氢或c1-c6烷基；
r为含氮或不含氮的结构片段；
r2,r3可为氢，含氮或不含氮的结构片段，
所述不含氮的结构片段为c1-c20烷基；
所述含氮的片段结构为：
linker1为c2-c6直链或支链烷基，nr4r5为一级胺或二级胺，
本发明优选具有如下结构的化合物：
其中，x为h、c1-c6烷基；
linker为取代或未取代的c6-c10芳酰(磺酰)基或杂芳酰(磺酰)基，所述取代基为c1-c6烷基，c1-c6烷氧基，卤素，氨基，硝基，巯基，硫醚，砜，亚砜，胺基烷氧基。
r1为氢或c1-c6烷基；
r为含氮或不含氮的结构片段；
r2,r3可为氢，含氮或不含氮的结构片段，
所述不含氮的结构片段为c1-c10烷基；
所述含氮的片段结构为：
linker1为c2-c6直链或支链烷基；
nr4r5为一级胺或二级胺，选自但不限于：
本发明的八氢蒽类化合物及其药学上可接受的盐，选自但不限于：
4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酸甲酯；
4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酸；
n-羟基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺；
n-(2-氨基苯基)-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺；
n-[2-(n,n-二乙胺基)]乙基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺；
n-(2-氨基)乙基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺；
n-[2-(n,n-二甲胺基)]乙基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺；
n-(2-羟基苯基)-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺；
4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯胺；
4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酸乙酯；
4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酰基-1-吗啡啉；
1-(2-氨基苯基)-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
1-(2-氨基)乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
1-(2-羟基)乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
1-(3-羟基)丙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
n,n-二甲磺酰基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯胺；
1-(4-羧丙基)-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
n-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酰基}-4-哌啶基甲酸；
4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酸甲酯；
1-(2-羟基苯基)-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
1-[2-(n,n-二乙胺基)]乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
1-[2-(n,n-二甲胺基)]乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
1-羟基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲；
4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酸-o-氨基酯。
本发明化合物的合成路线如下，其中x为甲基的化合物合成，起始原料为2,5-二甲基-2,5-己二醇，经氯代、傅克烷基化、硝化、还原、成酰胺、水解再成酰胺，或第一次成酰胺后、还原、成脲：
各步反应条件：acon.hcl,80℃,1h；balcl3,dcm,r.t.,2h；cch3cooh,con.hno3+con.h2so4,dcm,40℃,3h；dsn/hcl(g),con.hcl,ethanol；esocl2,1ddmf,reflux,3h；fdmap,py,xylol,reflux,12h；g8％naoh(aq),ch3oh,reflux,23h；hsocl2/dcm,reflux,3h,tea,primaryamine；idmap,py,xylol,reflux,12h；jpd-c/h2,c2h5oh,thf,30℃,25h；kbtc/dcm,tea,amine
附图说明：
图1为针对aβ的治疗策略；
图2为y迷宫实验装置；
图3为morris水迷宫实验装置。
具体实施方式：
化合物的熔点采用x-4型数字显示熔点测定仪测定，温度计未经校正。核磁共振1h-nmr采用brukerarx-300或600核磁共振仪测定，tms为内标。液质(lc-ms-esi)采用agilent1100seriesmsdtrap(sl)等测定。所用试剂均为分析纯，并经进一步纯化处理。
实施例1.中间体1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-氨基蒽的制备
1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢蒽(oa)的制备
将2,5-二氯-2,5-二甲基己烷(100g，0.546mol)置于1l三口瓶中，用500ml干燥二氯甲烷使其全溶(室温下)。用移液管移取苯(24.3ml，0.273mol)滴入到上述溶液中，搅拌10min，分批缓缓加入无水alcl3(7.3g，0.0546mol)，剧烈反应，温度无明显变化，溶液颜色逐渐加深至深褐色并有固体析出，反应2h后，将反应液缓缓倾入装有500ml冰水混合物(ph事先用浓盐酸调至酸性)的2l烧杯中，搅拌1h后再用1l二氯甲烷进行萃取，有机层用蒸馏水洗涤至中性，再用少量饱和nacl水溶液洗涤，无水na2so4干燥3h，抽滤，蒸去溶剂得79g淡黄色固体，收率97％。m.p.219～221℃。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)7.18(2h,s,ar-h),1.65(8h,s,4×ch2),1.26(24h,s,8×ch3)。
实施例2.1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-硝基蒽的制备
将oa(10g，33.5mmol)置于250ml三口瓶中，用130ml二氯甲烷使其全溶，室温下加入6.2ml冰醋酸，用滴液漏斗缓缓加入混酸(浓硝酸(4.6ml，67mmol)置于100ml小烧杯中，冰浴条件下，缓缓加入浓硫酸(10.6ml，195mmol)，搅拌0.5h，备用)，滴加完毕后，升温至40℃反应3h，将反应液缓缓倾入600ml冰水混合物中，抽滤，滤渣洗涤至中性，烘干得6.9g黄色固体，滤液洗涤至中性，无水硫酸镁干燥，抽滤，蒸干溶剂得4.3g棕红色粘稠物。柱层析分离(洗脱剂：pe)，得6.6g淡黄色晶体，收率57％。m.p.269～270℃。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)7.40(1h,s,ar-h),1.72～1.61(8h,m,4×ch2),1.29(12h,s,4-ch3)，1.28(12h,s,4×ch3)。
实施例3.1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-氨基蒽(oa-hy)的制备
将1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-硝基蒽(10g，29.1mmol)置于500ml三口瓶中，依次加入锡粒(30g，252.7mmol)、200ml无水乙醇、10ml浓盐酸，向反应液中缓缓通入氯化氢气体，回流反应3h后，停止通入氯化氢气体，有锡粒剩余，冷却过夜。次日，有少量晶体析出，加入部分二氯甲烷使其全溶后，抽滤，除去锡粒，蒸去有机溶剂，残余物中加入500ml蒸馏水搅拌2h，抽滤，滤渣洗涤至中性，干燥得8.97g白色固体，收率98.3％。m.p.246～248℃。lc-ms(esi)m/z:314.35[m+h]+。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)6.81(1h,s,ar-h),1.74～1.62(8h,m,4×ch2),1.48(12h,s,4×ch3),1.30(12h,s,4×ch3)。
oaa系列化合物的制备
3.1.2.14-甲氧羰基苯甲酰氯的制备
将10g对苯二甲酸单甲酯粗品置于250ml单口瓶中，用150ml甲醇无水和60ml5％盐酸进行重结晶，有少量不溶物，将上清液趁热倾入锥形瓶中，冷却析晶，抽滤，滤渣洗涤至中性，烘干得6.5g白色晶体。
将对苯二甲酸单甲酯(6.0g，33.3mmol)置于100ml单口瓶中，加入30ml氯化亚砜，1滴n,n-二甲基甲酰胺，回流反应，3h后常压蒸去溶剂，残余物加入环己烷(3×10ml)，蒸去溶剂得6.4g白色固体，收率97％。
实施例4.4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酸甲酯(oaa-01)的制备
将oa-hy(1.0g，3.19mmol)置于50ml单口瓶中，加入28ml干燥二甲苯使其全溶，再依次加入对二甲氨基吡啶(0.08g，0.65mmol)、干燥吡啶(3.0ml，37.3mmol)、4-甲氧羰基苯甲酰氯(1.27g，6.38mmol)，氩气保护，回流反应12h，缓缓降温至80℃，向反应液中缓缓滴入甲醇无水约10ml，后将其转移至500ml单口瓶中，加甲醇无水至约250ml，回流3h,趁热过滤，滤渣用蒸馏水洗涤，烘干得1.25g白色固体，收率82％。m.p.>300℃。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)8.20～8.18(2h,d,j＝8.4hz),8.02～8.00(2h,d,j＝8.4hz),7.54(1h,s,-nh-co-),7.35(1h,s,ar-h),3.97(3h,s,-och3),1.83～1.46(8h,m,4×ch2),1.42(6h,s,2×ch3),1.32(6h,s,2×ch3),1.27(6h,s,2×ch3),1.25(6h,s,2×ch3)。
实施例5.4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酸(oaa-02)的制备
将oaa-01(1.75g，3.68mmol)置于500ml单口瓶中，依次加入70ml8％氢氧化钠水溶液、175ml甲醇无水，回流8h，补加40ml8％氢氧化钠水溶液，回流15h，抽滤，滤液调ph至6，抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤三次，烘干得1.1g白色固体。取0.75g固体用甲醇进行重结晶，置于冰箱中冷冻析晶，抽滤烘干得0.63g白色固体，收率54％。m.p.>300℃。lc-ms(esi)m/z:460.1[m-h]-,462.4[m+h]+,484.3[m+na]+,500.3[m+k]+。1h-nmr(300mhz,cd3od):δ(ppm)8.21～8.17(2h,d,j＝8.7hz),8.15～8.11(2h,d,j＝8.7hz),7.42(1h,s,ar-h),1.81～1.51(8h,m,4×ch2),1.45(6h,s,2×ch3),1.32(6h,s,2×ch3),1.28(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3)。
实施例6.n-羟基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺(oaa-03)的制备
将oaa-02(0.4g，0.868mmol)加入到100ml三口瓶中，加入50ml干燥thf，搅拌，冰浴条件下(4℃)加入tea(0.24ml，1.735mmol)，滴加氯甲酸乙酯(0.17ml，1.735mmol)，有白烟生成，加毕，搅拌30min，溶液为乳白色，用滴液漏斗缓缓加入少量甲醇溶解的盐酸羟胺(0.12g，1.735mmol)，20min滴毕，继续冰浴搅拌10min，撤去冰浴，室温反应28h，冰浴下补加tea(0.48ml，3.47mmol)，溶液变为粉色，氯甲酸乙酯(0.34ml，3.47mmol)，溶液逐渐变为乳白色，搅拌约20min，点板发现oaa-02点几乎没有，滴加用甲醇溶解的盐酸羟胺(0.24g，3.47mmol)，撤去冰浴，室温反应16h，测溶液ph为1，补加tea(0.5ml，3.5mmol),溶液变为粉色，ph约为6，室温继续反应10h，溶液颜色变浅，补加0.5mltea，12h后停止反应，溶液为粉色，抽滤，滤液蒸干得残渣。将残渣用50ml二氯甲烷全溶，将其转移至分液漏斗中，用20ml10％盐酸与30ml蒸馏水萃取，溶液立即变为乳白色混浊物，补加200ml二氯甲烷，用蒸馏水洗涤至中性，饱和食盐水洗涤一次，溶液变澄清，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥。水层混合，用100ml二氯甲烷萃取，二氯甲烷依次用蒸馏水洗涤至中性，饱和食盐水洗涤一次，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥。将两批二氯甲烷层抽滤，滤液蒸干得0.4g。柱层析分离(ch3oh:dcm＝1:50)，得70mg粉色固体，收率17％。m.p.296-299℃(243℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:472.2[m-h]-。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.25(1h,s,ar-nh-co-),8.15～8.12(2h,d,j＝8.1hz),7.91～7.88(2h,d,j＝8.7hz),7.35(1h,s,ar-h),1.69～1.40(8h,m,4×ch2),1.40(6h,s,2×ch3),1.30(6h,s,2×ch3),1.25(6h,s,2×ch3),1.11(6h,s,2×ch3)。
实施例7.n-(2-氨基苯基)-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺(oaa-04)的制备
将oaa-02(0.5g，1.084mmol)置于100ml单口瓶中，加入20ml氯化亚砜，30ml干燥二氯甲烷，回流反应3h，常压蒸除溶剂得0.54g淡黄色固体。收率96％。
将上述淡黄色固体(0.15g，0.313mmol)加入到50ml单口瓶中，加入30ml干燥1,2-二氯乙烷溶解，搅拌下加入0.5ml干燥三乙胺，搅拌10min后，加入邻苯二胺(0.07g，0.647mmol)，逐渐升温至回流反应，氩气保护，溶液逐渐变澄清，9h后停止反应。将反应液倾入分液漏斗中，用饱和食盐水洗涤三次后，有机层用无水硫酸钠干燥过夜，抽滤，滤液蒸干得0.13g。柱层析分离(洗脱剂pe:ea＝4：1——dcm:ch3oh＝100：1)，得0.01g白色固体，收率6％。m.p.>300℃(270℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:552.3[m+h]+,574.2[m+na]+,590.2[m+k]+,550.1[m-h]-,586.1[m+cl]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.76(1h,s,-co-nh-ar-nh2),9.30～9.25(1h,d,ar-nh-co-),8.23～8.21(2h,d,2ar-h),8.14～8.11(2h,m,2ar-h),7.37(1h,s,ar-h),7.21～7.20(1h,m,h-ar-nh2),7.01～6.99(1h,m,h-ar-nh2),6.81～6.79(1h,m,h-ar-nh2),6.63～6.61(1h,m,h-ar-nh2),4.98(2h,s,ar-nh2),1.71～1.11(32h,m,4×ch2,8×ch3)。
通过类似方法合成以下化合物：
实施例8.n-(2-羟基苯基)-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺(oaa-12)
柱层析分离(dcm:ch3oh＝300:1)，得0.02g淡黄色固体，收率7％。
m.p.292～294℃(287℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:553.2[m+h]+,575.2[m+na]+,551.1[m-h]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.75(1h,s,-co-nh-ar-oh),9.65～9.64(1h,d,-oh),9.32～9.27(1h,d,ar-nh-co-),8.23～8.21(2h,d,2ar-h),8.13～8.09(2h,m,2ar-h),7.69～7.67(1h,m,h-ar-oh),7.37(1h,s,ar-h),7.08～7.05(1h,m,h-ar-oh),6.95～6.94(1h,m,h-ar-oh),6.87～6.84(1h,m,h-ar-oh),1.71～1.11(32h,m,4×ch2,8×ch3)。
实施例9.n-[2-(n,n-二乙胺基)]乙基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺(oaa-05)的制备
将oaa-04的制备中的酰氯(0.24g，0.5mmol)加入100ml单口瓶中，用30mldcm溶解(未全溶)，在用移液管加入1.0mltea(白烟生成，未全溶)，搅拌10min后，加入n,n-二乙基乙二胺(0.15ml，1.0mmol)，溶液逐渐澄清，40℃反应，ar气保护，反应12h后，停止反应。将反应液倾入125ml分液漏斗中，用5ml5％naoh水溶液洗涤一次，饱和食盐水洗涤三次(有不溶物分在水层)，有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，蒸干得0.17g。将上述固体柱层析分离(pe:tea＝1000：1润柱，洗脱剂为dcm:ch3oh＝60:1)，得0.04g白色固体，收率14％。m.p.272～274℃(265℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:560.42[m+h]+。1h-nmr(300mhz,cdcl3):δ(ppm)8.02～7.92(4h,m,-co-ar-4h),7.53(1h,s,ar-nh-co-),7.34(1h,s,ar-h),7.1(1h,s,-co-nh-ch2-),3.54～3.52(2h,m,-co-nh-ch2-),2.70～2.68(2h,m,-nh-ch2-ch2-),2.65～2.57(4h,q,j＝6.9hz,2-ch2-ch3),1.85～1.24(32h,m,4×ch2,8×ch3),1.10～1.05(6h,t,j＝6.9hz,2×ch2-ch3)。
通过类似方法合成以下化合物：
实施例10.n-(2-氨基)乙基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺(oaa-06)
柱层析分离(pe:tea＝1000：1润柱，洗脱剂为dcm:ch3oh＝20:1)，得0.05g白色固体，收率20％。m.p.268～273℃(221℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:504.3[m+h]+。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)7.96～7.94(4h,m,-co-ar-4h),7.69(1h,s,ar-nh-co-),7.43(1h,s,ar-h),7.1～7.06(1h,t,-co-nh-ch2-),3.53～3.51(2h,m，-co-nh-ch2-),2.96～2.93(2h,m,-nh-ch2-ch2-),1.817(2h,s,-nh2),1.80～1.21(32h,m,4×ch2,8×ch3)。
实施例11.n-[2-(n,n-二甲胺基)]乙基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯甲酰胺(oaa-07)
柱层析分离(pe:tea＝1000：1润柱，洗脱剂为dcm:ch3oh＝60:1)，得0.06g白色固体，收率22％。m.p.269～273℃(264℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:532.3[m+h]+。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)8.02～7.94(4h,m,-co-ar-4h),7.54(1h,s,ar-nh-co-),7.35(1h,s,ar-h),6.98(1h,s,-co-nh-ch2-),3.57～3.54(2h,q,j＝5.4,-co-nh-ch2-),2.57～2.55(2h,t,j＝5.4,-nh-ch2-ch2-),2.30(6h,s,2×ch3),1.82～1.24(32h,m,4×ch2,8×ch3)。
oab系列化合物的制备
实施例12.4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯胺(oab-01)的制备
将oa-hy(1.0g，3.19mmol)置于100ml单口瓶中，加入30ml干燥二甲苯使其全溶，再依次加入dmap(0.08g，0.65mmol)、干燥py(3.0ml，37.3mmol)、对硝基苯甲酰氯(1.18g，6.38mmol)，氩气保护，回流反应12h，缓缓降温至70℃，向反应液中缓缓滴入甲醇无水约20ml，后将其转移至500ml单口瓶中，加甲醇无水至约250ml，回流2h,趁热过滤，滤渣用蒸馏水洗涤，烘干得1.27g酰胺中间体。收率86.2％。将上述酰胺中间体(1.0g，2.16mmol)置于250ml单口瓶中，加入50ml无水乙醇与130ml四氢呋喃混合溶剂，未全溶条件下加入0.1g钯碳(钯含量10％)，氩气换气三次，氢气换气三次，30℃反应25h，向反应液中加入50ml的二氯甲烷，搅拌30min，普通漏斗过滤，滤液蒸干得0.9g白色粉末，收率96％。m.p.308-310℃。lc-ms(esi)m/z:433.2[m+h]+,455.2[m+na]+,471.1[m+k]+。1h-nmr(300mhz,cdcl3):δ(ppm)7.76～7.73(2h,d,j＝8.7hz),7.30(1h,s,ar-h),7.27(1h,s,-nh-co-),6.72～6.70(2h,d,j＝8.4hz),1.84～1.19(32h,m,4×ch2,8×ch3)。
实施例13.4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酸乙酯(oab-02)的制备
将oab-01(0.22g，0.5mmol)置于100ml单口瓶中，加入50ml干燥thf，未全溶，再依次加入tea(0.2ml，1.43mmol)，氯甲酸乙酯(0.1ml，1.0mmol)，室温反应2.5h，40℃反应17.5h，补加0.2mltea，0.15ml氯甲酸乙酯，40℃反应5.5h，60℃反应19h，补加0.2ml氯甲酸乙酯，60℃反应3h后，几乎反应完全，停止反应，抽滤，滤液蒸干，用约200mldcm使其全溶后，用蒸馏水洗涤两次，饱和食盐水洗涤一次，用无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液蒸干得0.17g淡黄色固体，收率67％。m.p.277～279℃(237℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:505.34[m+h]+。1h-nmr(300mhz,cdcl3):δ(ppm)7.91～7.87(2h,d,j＝8.7hz),7.53～7.50(2h,d,j＝8.7hz),7.40(1h,s,-nh-co-),7.32(1h,s,ar-h),6.76(1h,s,-nh-co-o-),3.30～3.23(2h,m,-och2-),1.84～1.19(32h,m,4×ch2,8×ch3),1.14～1.08(3h,m,-ch3)。
实施例14.4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酰基-1-吗啡啉(oab-03)的制备
将oab-01(0.22g，0.5mmol)置于50ml单口瓶中，用25ml干燥dcm全溶后，加入干燥tea(0.2ml，1.43mmol)，再加入btc(0.1g，0.33mmol)，瞬间出现白烟即有固体析出，室温反应1.5h后加入吗啡啉(0.1ml，1.14mmol)，室温反应3h后补加0.1ml吗啉，继续室温反应19h，抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤后于表面皿烘干得0.2g白色固体，收率73％。m.p.299～301℃(291℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:505.34[m+h]+。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)8.75(1h,s,-nh-co-),8.72(1h,s,-nh-co-n＝),7.98～7.95(2h,d,j＝8.4hz),7.62～7.58(2h,d,j＝8.7hz),7.32(1h,s,ar-h),3.64～3.60(4h,m,2×och2),3.48～3.44(4h,m,2×nch2),1.66～1.30(8h,m,4×ch2),1.40(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.12(6h,s,2×ch3)。
实施例15.1-(2-氨基苯基)-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-04)的制备
将oab-01(0.22g，0.5mmol)置于100ml三口瓶中，用30ml干燥dcm全溶后，加入干燥tea(0.2ml,1.43mmol)，再加入(0.06g,0.2mmol)btc，立即出现浑浊，室温下反应30min后，向反应液中加入邻苯二胺(0.05g，0.5mmol)，室温反应10h，抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤五次后烘干得0.12g浅粉色固体，收率42％。m.p.251～257℃(231℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:567.3[m+h]+,589[m+na]+,605[m+k]+。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)10.57(2h,s,-nh-co-nh-),9.20～9.16(1h,m,-nh2),8.9(1h,s,-nh-co-),8.04～8.02(2h,d,j＝8.4hz),7.97～7.93(1h,m,-nh2),7.60～7.58(2h,d,j＝9.0hz),7.38～7.37(1h,m,h-ar-nh2),7.34(1h,s,ar-h),6.89～6.86(1h,m,h-ar-nh2),6.78～6.76(1h,m,h-ar-nh2),6.63～6.60(1h,m,h-ar-nh2),1.72～1.49(8h,m,4×ch2),1.46(6h,s,2×ch3),1.30(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.11(6h,s,2×ch3)。
用类似方法合成下列化合物
实施例16.1-(2-氨基)乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-14)
0.08g白色固体，收率31％。m.p.>300℃。lc-ms(esi)m/z:519.3[m+h]+,541.2[m+na]+,557.2[m+k]+。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)8.93(1h,s,ar-nh-co-nh-),8.83(1h,s,-nh-co-),7.97～7.95(2h,d,j＝8.4hz),7.52～7.50(2h,d,j＝8.4hz),7.32(1h,s,ar-h),6.35～6.33(1h,t,j＝5.4hz,ar-nh-co-nh-),3.11～3.08(2h,q,j＝6.0hz,-co-nh-ch2-),2.64～2.62(2h,t,j＝6.0hz,-ch2-nh2),1.70～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.09(6h,s,2×ch3)。
实施例17.1-(2-羟基)乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-17)
0.13g白色固体，收率50％。m.p.284～287℃(278℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:520.3[m+h]+,542.2[m+na]+,564.3[m+hcoo]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)8.90(1h,s,ar-nh-co-nh-),8.85(1h,s,-nh-co-),7.98～7.96(2h,d,j＝8.4hz),7.52～7.50(2h,d,j＝9.0hz),7.33(1h,s,ar-h),6.32～6.30(1h,t,j＝5.4hz,ar-nh-co-nh-),4.78～4.76(1h,t,j＝5.4hz,-oh),3.47～3.44(2h,q,j＝5.4hz,-co-nh-ch2-),3.19～3.16(2h,q,j＝5.4hz,-ch2-oh),1.70～1.41(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3)。
实施例18.1-(3-羟基)丙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-18)
0.16g白色固体。收率60％。m.p.280～282℃。lc-ms(esi)m/z:520.3[m+h]+,542.2[m+na]+,564.3[m+hcoo]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)8.84(1h,s,-nh-co-),8.80(1h,s,ar-nh-co-nh-),7.98～7.96(2h,d,j＝8.4hz),7.52～7.50(2h,d,j＝8.4hz),7.33(1h,s,ar-h),6.27～6.25(1h,t,j＝5.4hz,ar-nh-co-nh-),4.53～4.51(1h,t,j＝4.8hz,-oh),3.48～3.45(2h,q,j＝5.4hz,-co-nh-ch2-),3.18～3.15(2h,q,j＝6.6hz,-ch2-oh),1.70～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3),1.61～1.57(2h,m,-ch2-ch2-ch2-)。
实施例19.n,n-二甲磺酰基-4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯胺(oab-05)的制备
将oab-01(0.22g，0.5mmol)置于50ml三口瓶中，用30ml干燥dcm全溶后，加入干燥tea(0.2ml,1.43mmol)，冰水浴(2～3℃)条件下，缓缓滴加甲基磺酰氯(0.1ml,1.25mmol)，0.5h后反应完全。将反应液倾入125ml分液漏斗中，用5％盐酸洗涤(10ml×1)，饱和食盐水洗涤(15ml×3)，dcm层用无水硫酸钠干燥3h，抽滤，滤液蒸干得0.16g淡黄色固体，收率54％。m.p.283～286℃。lc-ms(esi)m/z:589.2[m+h]+,611[m+na]+,627.1[m+k]+。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)8.05～8.03(2h,d,j＝8.4hz),7.53～7.51(2h,d,j＝8.4hz),7.51(1h,s,-nh-co-),7.35(1h,s,ar-h),3.44(6h,s,2×ch3),1.82～1.42(8h,m,4×ch2),1.41(6h,s,2×ch3),1.30(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.23(6h,s,2×ch3)。
实施例20.1-(4-羧丙基)-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-07)的制备
将oab-01(0.22g，0.5mmol)置于100ml三口瓶中，用30ml干燥dcm全溶后，加入干燥tea(0.2ml,1.43mmol)，再加入(0.05g,0.17mmol)btc，立即出现浑浊，室温下反应30min后，向反应液中加入4-氨基丁酸(0.05g，0.5mmol)，室温反应27h，抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤五次后烘干得0.06g白色粉末。收率21％，m.p.277～280℃(252℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:562.3[m+h]+,584.2[m+na]+,600.2[m+k]+,560.1[m-h]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.11(1h,s,ar-nh-co-nh-),8.84(1h,s,ar-nh-co-),7.98～7.96(2h,d,j＝8.4hz),7.55～7.53(2h,d,j＝8.4hz),7.34(1h,s,ar-h),6.68(1h,s,ar-nh-co-nh-),3.61(w,-cooh),3.12～2.23(6h,m,-ch2-ch2-ch2-),1.80～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3)。
实施例21.用类似方法合成了n-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酰基}-4-哌啶基甲酸(oab-09)
白色固体0.21g，收率71％。m.p.>300℃(283℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:588.3[m+h]+,610.3[m+na]+。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)8.86(1h,s,ar-nh-co-n＝),8.80(1h,s,ar-nh-co-),7.98～7.96(2h,d,j＝8.4hz),7.60～7.59(2h,d,j＝8.4hz),7.33(1h,s,ar-h),4.05～4.02(2h,m,-co-n＝ch2),2.96～2.92(2h,m,-co-n＝ch2),1.86～1.84(2h,m,＝n-ch2-ch2-),1.50～1.46(2h,m,＝n-ch2-ch2-),1.71～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3)。
实施例22和23.4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酸甲酯(oab-08)与1-(2-羟基苯基)-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-10)的制备
将oab-01(0.22g，0.5mmol)置于100ml三口瓶中，用30ml干燥dcm全溶后，加入干燥tea(0.2ml,1.43mmol)，再加入(0.05g,0.17mmol)btc，立即出现浑浊，室温下反应30min后，抽滤得0.2g白色固体。
oab-08的制备：
将上述白色固体(0.1g,0.22mmol)置于50ml单口瓶中，加入20ml甲醇无水，回流3h后得0.08g白色粉末，收率74％。m.p.277～281℃(254℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:491.3[m+h]+,513[m+na]+,529.2[m+k]+。1h-nmr(600mhz,cdcl3):δ(ppm)7.92～7.90(2h,d,j＝8.4hz),7.55～7.53(2h,d,j＝7.8hz),7.43(1h,s,-nh-co-),7.33(1h,s,ar-h),6.81(1h,s,ar-nh-co-o-),3.81(3h,s,-ch3),1.90～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.23(6h,s,2×ch3)。
oab-10的制备：
将上述白色固体(0.1g,0.22mmol)置于100ml单口瓶中，加入50ml干燥dcm，再加入邻氨基酚(0.025g，0.23mmol)，室温反应30h后，抽滤，滤渣用蒸馏水洗涤五次，烘干得0.05g淡粉色粉末，收率74％。m.p.>300℃。lc-ms(esi)m/z:568.3[m+h]+,590.2[m+na]+,606.2[m+k]+,566.2[m-h]-,602[m+cl]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.97(1h,s,-oh),9.63(1h,s,-nh-co-nh-),8.9(1h,s,-nh-co-),8.26(1h,s,-nh-co-nh-),8.06～8.05(1h,m,h-ar-oh),8.04～8.02(2h,d,j＝7.8hz),7.60～7.58(2h,d,j＝8.4hz),7.33(1h,s,ar-h),6.86～6.74(3h,m,3h-ar-oh),1.71～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3)。
实施例24.1-[2-(n,n-二乙胺基)]乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-12)的制备
将oab-01(0.11g，0.25mmol)置于50ml三口瓶中，用15ml干燥dcm全溶后，加入干燥tea(0.15ml,1.07mmol)，搅拌5min，再加入(0.03g,0.1mmol)btc，立即出现浑浊，室温下反应30min后，用移液管将n,n-二乙基乙二胺(0.1ml,0.75mmol)缓缓滴入反应液中，溶液逐渐变为澄清，室温反应20h，将反应液倾入分液漏斗中，加入部分dcm，依次用5％盐酸(5ml×1)、蒸馏水(30ml×2)，饱和食盐水(10ml×1)洗涤至中性，无水硫酸钠干燥3h，抽滤，滤液蒸干得0.16g淡黄色固体。对其进行柱层析分离(洗脱剂为ea——ch3oh:dcm＝2.5：1)，得0.05g白色固体，收率35％。m.p.286～289℃(261℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:575.3[m+h]+,573.3[m-h]-,609.2[m+cl]-,619.3[m+hcoo]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.01(1h,s,ar-nh-co-nh-),8.84(1h,s,-nh-co-),7.98～7.96(2h,d,j＝8.4hz),7.52～7.50(2h,d,j＝8.4hz),7.33(1h,s,ar-h),6.16～6.14(1h,t,j＝5.4hz,ar-nh-co-nh-),3.17～3.14(2h,q,j＝6.0hz,-co-nh-ch2-),2.48～2.46(2h,t,j＝6.0hz,-ch2-n＝),1.71～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3),1.0～0.9(6h,t,2×ch2ch3)。
实施例25.用类似方法制备1-[2-(n,n-二甲胺基)]乙基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-13)
对其进行柱层析分离(洗脱剂为ea——ch3oh:dcm＝2.5：1)，0.06g白色固体，收率44％。m.p.297～301℃(291℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:547.4[m+h]+,545.2[m-h]-,581.2[m+cl]-。1h-nmr(600mhz,dmso-d6):δ(ppm)8.98(1h,s,ar-nh-co-nh-),8.83(1h,s,-nh-co-),7.97～7.95(2h,d,j＝8.4hz),7.51～7.49(2h,d,j＝8.4hz),7.33(1h,s,ar-h),6.21～6.20(1h,t,j＝5.4hz,ar-nh-co-nh-),3.21～3.18(2h,q,j＝5.4hz,-co-nh-ch2-),2.34～2.32(2h,t,j＝6.0hz,-ch2-n＝),2.18(6h,s,2×n＝ch3),1.70～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3)。
实施例26和27.1-羟基-3-{4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯基}脲(oab-15)和4-[(1,1,4,4,5,5,8,8-八甲基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-9-蒽基)氨甲酰基]苯氨基甲酸-o-氨基酯(oab-16)的制备
将oab-01(0.22g，0.5mmol)加入100ml单口瓶中，加入50ml干燥dcm使其全溶(室温)，然后依次加入tea(0.2ml,1.43mmol)，btc(0.06g，0.2mmol)，室温下反应0.5h，向其中加入盐酸羟胺(0.04g，0.57mmol)，室温下反应2days(发现未反应)，回流反应40h。将反应液倾入125ml分液漏斗中，用10ml1mol/lhcl水溶液洗涤一次，然后用蒸馏水一次，用饱和食盐水洗至中性，有机层用无水硫酸钠干燥，抽滤，蒸干，得0.14g固体。柱层析分离(洗脱剂为dcm:ch3oh＝60：1)。
oab-15
淡粉色固体0.01g，收率4％。m.p.290～294℃(270℃变黄)。lc-ms(esi)m/z:534.3[m+h]+。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.05(2h,m,ar-nh-co-nh-oh),9.00(1h,s,ar-nh-co-nh-oh),8.9(1h,s,-nh-co-),8.0～7.97(2h,d,j＝8.4hz),7.79～7.63(2h,d,j＝9.0hz),7.33(1h,s,ar-h),1.70～1.40(8h,m,4×ch2),1.39(6h,s,2×ch3),1.29(6h,s,2×ch3),1.24(6h,s,2×ch3),1.10(6h,s,2×ch3)。
oab-16
白色固体0.01g。收率4％。m.p.>300℃。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)10.51(1h,s,ar-nh-co-o-),9.03(1h,s,-nh-co-),8.1～8.07(2h,d,j＝8.4hz),7.79～7.76(2h,d,j＝8.7hz),7.35(1h,s,ar-h),1.70～1.40(8h,m,4×ch2×),1.40(6h,s,2×ch3),1.30(6h,s,2×ch3),1.25(6h,s,2×ch3),1.11(6h,s,2×ch3)。
二、生物活性部分
(一).抗肿瘤活性实验
1.实验样品和材料：
1.1、受试品
oab-1、2、3、4、5、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18，oaa-1、2、3、4、5、6、7、12。
1.2、实验细胞株及来源
1.3、实验试剂
2、实验方法
2.1、药物处理
化合物均配制成相同浓度的母液(100mmol/l)，储存于-20℃。细胞增殖抑制试验中，初筛时用rpmi1640培养基将试验药物及阳性药saha、bexa稀释为10μmol/l进行实验。dmso配置的样品进行实验时，dmso的终浓度为1‰。复筛时将初筛出的药物及阳性药saha、bexarotene浓度设为100μmol/l、10μmol/l、1μmol/l、和0.1μmol/l。hdac靶点确证试验中，初筛时实验药物及阳性药saha浓度设为20μmol/l，复筛时药物浓度设为20μmol/l、2μmol/l、0.2μmol/l、0.02μmol/l。rxr靶点确证实验中，试验药物及阳性药bexa浓度设为20nmol/l。
2.2、mtt检验
1)mtt法的基本原理
细胞成活率测定采用mtt分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethyl-2thiahiazoy1)-3，5-di-phenyl-tetrazoliumbromide，mtt)为基础。mtt为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能和20％的十二烷基磺酸钠(ph4.7)的mtt溶解液中溶解，利用酶标仪测定492nm处的光密度od值，od值的大小与所生成的formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。
2)细胞处理
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％co2的培养箱内。贴壁过夜，换液加药，作用48h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设4个复孔。
3)mtt法的测定方法
药物作用48h后，将细胞与0.25mg/mlmtt于37℃下共同孵育3-4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(dmso)，完全溶解后使用酶标仪于492nm测定其光密度od值。最后以空白组od值为100％，计算各组细胞抑制率。
2.3、rxr靶点的确证
1)实验原理
质粒转染实验是通过分子生物学等手段构建含有目的dna序列的质粒，并且将质粒通过转染方法导入所研究的细胞中，观察生化指标的一种试验方法。比较常用的转染试剂为脂质体。脂质体包裹dna形成dna-脂质体复合物，通过静电作用吸附到细胞膜表面，经内吞被导入细胞内。在细胞内部，质粒会进行复制和表达。转染用的质粒上可连接有表达报告基因的序列，一般为表达萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase，flu)和海肾荧光素酶(renillaluciferase，rlu)的序列。本实验中，目的质粒含有flu的表达序列，其信号强度用来表示检测指标的活性。另外，在转染目的质粒的同时，转染另外一种含有rlu序列的空白质粒，其信号强度作为内参，使实验结果标准化。实验最终结果用双报告基因检测试剂盒检测。
2)细胞处理
1)转染前一天，胰酶消化293t细胞并计数，将细胞铺在96孔板中(每孔0.1～1×105细胞)，每孔加100μl含血清，不含抗生素的培养基。使细胞在转染日能达到90-95％的融合。
2)对于每孔细胞，使用25μl无血清如opti-mem培养基稀释0.2μgdna，轻轻混匀。
3)使用前将lipofectamine2000转染试剂轻轻混匀，每孔细胞用25μl无血清opti-mem稀释0.5μllipofectamine2000转染试剂，轻轻混匀，室温孵育5min。
4)混合稀释的dna和稀释的lipofectamine2000，此时总体积是50μl。轻轻混匀，室温放置20min以使dna-lipofectamine2000复合物形成。
5)将96孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入100μl无血清培养基。
6)逐滴加入50μl脂质体/dna混合物到每孔中，边加边晃动培养板，轻轻混匀。
7)转染4-5h后，换成含血清培养液。并加入药物。使药物终浓度为20nm，作用48h后检测。
3)检测方法
根据双报告基因检测试剂盒的说明书，配置所需要的被动裂解液(plb)，stop&
2.4、hdac靶点的确证
1)基本原理
药物对hdac活性的影响采用hdac活性检测试剂盒来考察。在样品(细胞裂解液)中加入含有乙酰化赖氨酸链的底物，样品中的有活性的hdac会将底物上的赖氨酸链去乙酰化，从而使底物活化。再加入赖氨酸发光试剂，即产生荧光，用酶标仪记录信号用于表示样品中hdac的活性。
2)测定方法
1)将未加药处理的a549细胞裂解液50μg溶解于85μl(终体积)的ddh2o中。对于阳性空白组，先加2μl的hela核提取物，再加入83μlddh2o。阴性空白组，加入2μltrichostatina和83μlddh2o。
2)每孔中加入10μl的10倍缓冲液。
3)每孔加入5μlhdac的荧光底物，并且加入药物，使终浓度达到所设定的浓度，充分混合，37℃孵育30min。
4)加入10μl赖氨酸显影液，充分混合，停止反应。37℃下孵育30min。
5)酶标仪检测荧光度值(条件为发射波长/激发波长为350-380/440-460nm)。
3、统计方法
全部资料采用spss(16.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(mean±s.e.)表示，采用one-wayanova评价整体性差异，并进行dunnett或dunnett’st3检验进行组间比较。
4、实验结果
4.1.mtt实验
(1)化合物对人白血病hl60细胞增殖的影响
实验结果如表1所示，药物10μm作用48h，化合物oab-12、13、oaa-6对hl60细胞增殖有显著抑制作用，抑制率均大于50％。选择10μm作用48h后抑制率大于50％的样品进行复筛，实验结果如表2所示。
表1.化合物(10μm)对hl60细胞株的存活抑制率(％)(mean±se)
***p＜0.001vscontrol；**p＜0.01vscontrol；*p＜0.05vscontrol.
表2.化合物对hl60细胞株的存活抑制率(％)(mean±se)
***p＜0.001vscontrol；**p＜0.01vscontrol；*p＜0.05vscontrol.
(2)化合物对人皮肤t细胞淋巴瘤hut102细胞增殖的影响
实验结果如表3所示。
表3.化合物(10μm)对hut102细胞株的存活抑制率(％)(mean±se)
***p＜0.001vscontrol；**p＜0.01vscontrol；*p＜0.05vscontrol.
4.2.rxr靶点的确证
经转染后的细胞，药物20nm作用48小时后，根据双报告基因检测试剂盒说明书进行检测，实验结果如表4所示，rxr均无显著的增加。
表4.化合物(20nm)对转染后的293t细胞的rxr活性的影响
4.3.hdac靶点的确证实验
实验结果如表5所示，未加药处理的细胞提取总蛋白后，药物20μm作用48h。
表5.化合物对a549细胞hdac活性的影响(％)(mean)
5、实验结论
化合物oab-12、13、oaa-6对hl60细胞增殖有显著抑制作用，ic50<10μmol/l。
mtt实验中筛选出的化合物对rxr的活性均无显著的作用。
(二)神经退行性疾病治疗活性实验
一)实验及实验方法：
aβ(6e10，covance)
thioflavins(sigma)
anti-iba1(abcam)
免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司
1.动物分组及给药
将9只8月龄c57bl/6小鼠作为空白对照组，45只同龄app/ps1转基因小鼠随机分为模型组，贝沙罗汀100mg/kg组、oab-1450mg/kg组、oab-14100mg/kg组和oab-14200mg/kg组，每组9只。适应性喂养3天后开始给药，以花生油为溶剂，每天灌胃给药1次，连续给药15天，给药后第6-9日进行新物体辨别实验，第10日进行y迷宫实验，第11-15日进行morris水迷宫实验，以确定对其学习记忆的改善作用，行为学实验期间继续给药，直到处死动物(第16天)。
2.行为学实验方法
2.1新物体辨别实验
实验装置为一木制的正方形开放场，长×宽×高为50×50×15cm。测试前2日，将小鼠放入实验场地中适应环境5min，每次1只，每日2次。测试当天，先将动物放入实验装置中自由探索3min以适应环境。取出动物，将2个完全相同的物体(a1、a2)置于装置内与壁平行的位置。将小鼠在实验装置的另一侧与两物体等距离处背对物体放入，记录5min内探索两物体的时间(ta1、ta2)。1h后，将a2换成一个新物体(b)，将小鼠再次放入，记录探索两物体所用时间(ta1、tb)。24h后，将物体b换成一个新物体(c)，将小鼠再次放入，记录探索两物体所用时间(ta1、tc)。小鼠以鼻尖正对物体且距离小于2cm或嗅、舔物体即被定义为探索行为，但爬上物体不算探索。每只小鼠移出场地后，迅速清理排泄物，并用10％的酒精擦拭场地以消除小鼠遗留的气味。分别计算每部分实验小鼠对新物体的优先指数preferentialindex及辨别系数discriminationindex。
优先指数计算公式如下：
preferentialindex(1h)＝tb/(ta1+tb)公式(1)
preferentialindex(24h)＝tc/(ta1+tc)公式(2)
辨别系数计算公式如下：
discriminationindex(1h)＝(tb-ta1)/(ta1+tb)公式(3)
discriminationindex(24h)＝(tc-ta1)/(ta1+tc)公式(4)。
2.2y迷宫实验
实验装置由三个夹角为120°的木制支臂组成，分别为a、b、c三臂。40×12×10cm(长×高×宽)。实验时将动物放入a臂末端，让其自由出入三个臂，记录小鼠5min内进入三个臂的总次数(numberofarmentries，n)以及进臂顺序。每只小鼠拿出场地后，迅速清理排泄物，并用10％的酒精擦拭场地以消除小鼠遗留的气味。以连续进入三个不同的臂为一次正确交替反应(successivealternation)，记录正确交替反应次数(numberofalternation)。用自发交替反应率(alternationbehavior,％)反映空间工作记忆能力。计算公式如下：
alternationbehavior(％)＝numberofalternation/(n-2)×100％
例如，动物规定时间内进入三个臂的顺序依次为：abccbacabcacbacb，其中n为16，而successivealternation为：abc、cba、bac、cab、bca、acb、bac，alternationbehavior(％)＝[7/(16-2)]×100％＝50％。
2.3morris水迷宫实验
实验装置为一个直径为100cm，高40cm的黑色圆形水池及一个直径约10cm的白色平台(安全台)。安全平台的位置可以移动。morris水迷宫视频检测分析系统，由中国医学科学研究院药物研究所提供。实验前一天水池中注水(水温22±1℃)，加入白色素混匀，水面通常高于安全平台顶端约1厘米左右。水池分ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ四个象限，平台通常设置于第ⅳ象限的中间。实验分为两部分进行：(1).定向航行：提前将动物分组情况输入电脑软件中。在实验过程中保持安全平台的位置不变。测试时，将实验动物面向池壁从不同入水口放入水中，电脑同时进行数据采集并记录其找到安全台的时间(逃避潜伏期)，动物在安全平台停留10秒后采集自动停止。小鼠数据采集时间为60秒，若动物在规定时间内未找到安全台，则逃避潜伏期记为60秒。同时操作者诱导动物到达安全平台，停留10秒。每天训练两次，连续训练4天。(2).空间探索(probetest):定向航行实验结束后，撤除安全平台，将动物放入水池中，自由探索60秒。摄像系统自动记录在规定时间内实验动物在安全平台所在象限游泳的时间、路程及穿越安全平台所在位置的次数等指标。
2.4社会交往实验
社会交往装置是由一个正方形盒子构成(长×宽×高：50×50×15cm)。行为学实验室采用弥散灰暗的灯光(25w)，并尽量避免实验区域内的阴影引发的环境紧张感。社会交往实验进行之前，为了排除陌生环境的影响，每只小鼠被单独放入该实验装置中适应环境，每天10min，连续两天。于第3天测试开始时，分别将小鼠与另一陌生的伙伴随机配对。两组实验动物同时放入实验装置内，记录小鼠在主动社会交往行为中所花费的时间，测试时间为10min，其中包括嗅舔、梳理以及抓挠或追逐对方等。但被动接触活动(被对方压倒或被骑在身上等)并不在社会交往行为记录中。每次测试结束后，用1‰的新洁尔灭消毒。
2.5筑巢实验
每只小鼠饲养在单独的笼子里。测试第一天，将两片棉花(5*5cm)放入笼内。24h及48h后拍照，以5分制进行评价[132]：1＝没有可见的碰触，2＝部分的撕开，3＝绝大部分碎片，但没有可识别的位置；4＝可识别的位置但是平整，5＝几乎完美。
3.蛋白免疫印迹法(westernblotting)检测脑组织中的蛋白表达情况
3.1取材
行为学实验后，动物腹腔注射3.5％水合氯醛麻醉，迅速断头取脑，冰面上分离海马和皮质，称重后液氮迅速冻存，置于-80℃冰箱内备用。
3.2组织蛋白质的提取
冻存的脑组织，按1：5(6ml/g组织)比例加入组织裂解液(每ml裂解液含有5ulpmsf蛋白酶抑制剂)，于冰槽内超声波均浆。匀浆后组织置碎冰中静置30min后，12000×g，4℃离心20min。取上清液(约200μl)，置于-80℃冰箱储存备用。取部分上清液进行蛋白定量。
3.3蛋白浓度的测定—bca法
按照试剂盒说明，按50：1配制bca工作液a和b并充分混匀。bca工作液临用时室温现配，稳定期为24h。⑴标准蛋白为5mg/mlbsa，pbs稀释到终浓度为0.5mg/ml。⑵将标准蛋白按0,1,2,4,8,12,16,20μl分别加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液(pbs)补到20μl，每个浓度加3个复孔。⑶蛋白上清液用pbs稀释100倍后，取20μl稀释液加到96孔板中，每个样品重复三次。⑷检测孔中分别再加入200μlbca工作液，37℃放置30min。⑸酶标仪测定蛋白的吸光度(波长540nm)。⑹excel做标准曲线，根据标准曲线计算检测蛋白的浓度。
3.4蛋白印迹分析
3.4.1sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)的配制
制胶程序如下：
①配制8-12％分离胶液。按照比例加入tris-nacl、聚丙烯酰胺及temed后，充分混匀，注入玻璃板间隙。
②在分离胶顶层注满的去离子水。
③室温静置30min，促进分离胶凝聚。
④分离胶凝聚后，倒掉覆盖的去离子水，把水甩干，再用滤纸轻吸凝胶顶端的残余液体。
⑤配制浓缩胶液，按上述的成分配制并充分混匀后注入玻璃板间隙，插入梳子，用凡士林封边，避免产生气泡，室温下聚合约50min。
⑥浓缩胶聚合后，拔除梳子，去除凡士林。放入有去离子水的自封袋中，4℃冰箱备用。
3.4.2电泳
将检测的蛋白在8-12％sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)中进行电泳分离。
①变性：根据bca法蛋白定量的结果，调整样品的蛋白浓度使其一致，加入5×sds-page蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，使蛋白充分变性，放入冰盒迅速冷去，备用。
②电泳缓冲液准备：按比例配制的5×电泳缓稀释为1×放入电泳槽中备用。
③上样：将蛋白质分子量标准品(蛋白marker)，各组实验样品上样，各加样孔分别加入40μg/12μl检测蛋白。
④电泳：开始时电压80v，marker分离后(成数条线后)，增加到110v，蓝色染料条带抵达分离胶底部，电泳终止。
3.4.3转膜
采用湿转的方式将蛋白质转移至pvdf膜上。
①剪适当大小的滤纸8张(由上样数量决定)，pvdf膜1张，在膜的一角做一记号，以示膜的正面。
②膜活化，剪好的pvdf膜依次浸入甲醇(10-30s)，去离子水(5min)，转移缓冲液30min以上。
③pvdf膜，滤纸和多孔滤网浸泡在转移缓冲液中30min以上。
④三明治制备，从正极→负极依次为多孔滤网→滤纸→pvdf膜→凝胶→(2张)滤纸→多孔滤网→黑夹板盒。制备的三明治扣上吊扣后放入转膜槽中。转膜槽内两侧加冰盒，防止转膜过程中产生过多热量。
⑤转膜，按照蛋白带负电荷接通电流，恒流或恒压电转移，时间根据待测蛋白的分子量而定(0.5-2h)，电流为100ma，电压100v。
3.4.4封闭和免疫反应
①封闭：转膜结束后，将pvdf膜按照分子量减成数条放入10mlpbs奶粉封闭液(blockingbuffer)，室温轻摇2h。
②加一抗：用pbs奶粉封闭液配制抗体，室温放置孵育5min后，置于4℃冰箱内过夜。
③一抗冲洗：用pbs缓冲液室温下清洗膜三次，10min/次，摇床上进行。
④加二抗：用tris-nacl封闭液配制二抗，均匀的加到pvdf膜上，室温孵育2h。
⑤二抗冲洗：用tris-nacl缓冲液室温下清洗膜三次，10min/次，并振摇。
3.4.5显影
用superecl发光液，经过显影，定影得到免疫反应条带。
①显影前准备：等体积发光液a液和b液混合。(液体量根据显影膜的大小决定，宜临检测时配制)。
②显色反应：tris-nacl缓冲液洗涤数次后，用滤纸吸去过多的发光液(避免接触膜的蛋白面)，然后置于自封袋上，滴入混合后的发光液。
③压片检测：将pvdf膜固定于暗盒内(蛋白面向上)。将胶片放在膜上，压片爆光。(压片时间由抗体效价强度而不同)
④显影：胶片放入显影液3分钟，观察显影情况。
⑤定影：显影后胶片在清水中清洗后放入定影液中，时间大于5min。观察目的条带的表达。
3.4.6图像扫描及定量分析
对x胶片进行灰度扫描，用quantityone4.6.2图像分析软件进行分析。以β-actin作为内参来确定各组间的检测蛋白表达的差异和变化。按公式计算出相对值。
相对值＝检测蛋白表达强度/β-actin表达强度
4.免疫組化染色
4.1组织样品的取材及制备
小鼠行为学实验结束后，腹腔注射3.5％水合氯醛(每只约3ul)麻醉，背位固定于手术台上，开胸暴露心脏。将灌流穿刺针从心尖部位插入左心室，同时右心耳剪一小口，先用约200ml生理盐水灌流，剪尾无血时，换用300ml4℃4％多聚甲醛缓冲液(0.1mol/l)灌流，直至躯体僵硬。断头取出整脑，置于4℃4％的多聚甲醛中固定。24h后，常规石蜡包埋，冠状切片，厚度5μm，用于免疫组织化学染色。
4.2免疫组织化学染色
用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶(sp)连接法进行免疫组化检测。使用sp免疫组化染色试剂盒，用生物素标记的二抗与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化酶及基质色素混合液测定组织中的抗原。具体实验步骤如下：组织切片脱蜡至水；微波抗原修复(aβ6e10染色用70％甲酸抗原修复)。
切片置于盛有抗原修复液的容器中，抗原修复液为枸橼酸盐缓冲液(0.01m，ph6.0)，置微波炉中高火加热至沸腾，自然冷却后，蒸馏水洗涤3min×3；3％h2o237℃孵育10min。pbs洗3min×3；滴加山羊血清封闭液室温封闭30min，吸去多余血清，滴加一抗，4℃孵育过夜，阴性对照以0.01mpbs缓冲液代替一抗；pbs洗5min×3；滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育30min，pbs洗5min×3；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30min，pbs洗5min×3；dab显色，显微镜下观察染色强度以控制反应时间，见切片中出现棕黄色显色，立即自来水冲洗，终止染色；苏木素复染3min；自来水洗；盐酸酒精分化数秒，自来水充分水洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用光学显微镜观察每个视野中aβ斑块表达，用计算机图像分析系统分别测定各组小鼠每张切片内aβ斑块面积。
4.3免疫荧光单标
4.3.1石蜡切片浸于二甲苯脱蜡15min，共2次；再浸于梯度酒精100％，100％，95％，90％，85％和75％，各5min。
4.3.2微波修复抗原：将切片浸于0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)中，微波炉中加热至沸腾，重复2次。自然冷却后，用pbs冲洗2次，每次5min。
4.3.3阻断内源性过氧化酶：脑组织周围用滤纸吸干，组化笔圈定脑组织。滴加过氧化酶阻断剂，室温下孵育10min，pbs冲洗3次，每次5min。
4.3.4滴加0.01mpbs1:10稀释的正常血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗。
4.3.5滴加0.01mpbs稀释一抗，4℃过夜。0.01mpbs洗3次，每次2min。
4.3.6滴加0.01mpbs1:100稀释的与一抗相对应的生物素化二抗，37℃30min，pbs冲洗3次，每次2min。
4.3.7滴加0.01mpbs1:100稀释的sabc-fitc(或sabc-cy3)，37℃30min，pbs冲洗4次，每次5min。
4.3.8水溶性封片剂封片。荧光显微镜观察。
4.4iba1和6e10免疫荧光双标
4.4.1石蜡切片浸于二甲苯脱蜡15min，共2次；再浸于梯度酒精100％，100％，95％，90％，85％和75％，各5min；pbs冲洗3次，每次5min。
4.4.2微波修复抗原：将切片浸于0.01m枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)中，微波炉中加热至沸腾，重复2次。自然冷却后，用pbs冲洗2次，每次5min。
4.4.30.3％triton-100室温孵育10min，pbs冲洗3次，每次5min。
4.4.4阻断内源性过氧化酶：脑组织周围用滤纸吸干，组化笔圈定脑组织。滴加过氧化酶阻断剂，室温下孵育10min，pbs冲洗3次，每次5min。
4.4.5滴加正常血清封闭液，37℃30min，甩去多余液体，不洗。
4.4.6滴加0.01mpbs稀释一抗，4℃过夜。pbs洗3次，每次10min。
4.4.7滴加0.01mpbs1:100稀释的fluorescein(fitc)-conjugatedaffinipuregoatanti-mouselgg(h+l)和cy3-conjugatedaffinipuregoatanti-rabbitlgg(h+l)，37℃60min，pbs冲洗5次，每次5min。
4.4.8水溶性封片剂封片。激光共聚焦显微镜观察。
5.硫磺素-s(thioflavin-s)荧光染色
5.1脑组织石蜡切片脱蜡至水；
5.2pbs洗3次，每次3min；
5.3阻断内源性过氧化酶：脑组织周围用滤纸吸干，组化笔圈定脑组织。滴加过氧化酶阻断剂，室温下孵育10min，pbs冲洗3次，每次3min。
5.4thioflavin-s乙醇溶液避光孵育10min；
5.5pbs避光摇床洗3次，每次3min；水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。
6.统计方法
实验数据用均数±标准误
二)实验结果
oab-14促进β淀粉样蛋白清除：oab-14在200mg/kg剂量下，仅连续灌胃14天即能减少8月龄app/ps1双转基因ad模型小鼠大脑皮质和海马67.4％的β淀粉样蛋白沉积，且在50-200mg/kg剂量范围内呈良好的量效关系，其减少β淀粉样蛋白斑块的机制与aβ生成酶无关，而是通过增加小鼠脑内aβ代谢酶nep和ide的表达、促进中枢神经系统中的小胶质细胞对β淀粉样蛋白的吞噬作用等机制。
oab-14减少tau蛋白过度磷酸化：生理情况下，wnt与卷曲蛋白结合抑制gsk-3β的活性，抑制tau蛋白的磷酸化，保护微管结构。神经生长因子也可以通过pi3k/akt通路抑制gsk-3β的活性。但在aβ存在下，与wnt竞争与卷曲蛋白的结合，解除对gsk-3β的抑制，使tau蛋白过度磷酸化。aβ的神经毒性也可减少神经营养因子的表达，抑制pi3k/akt通路，使tau蛋白磷酸化。oab-14可以解除aβ的抑制作用减少tau蛋白的磷酸化，保护神经微管蛋白，防止神经元缠结。
oab-14改善动物学习记忆及社交活动等行为学障碍：8月龄app/ps1双转基因ad模型小鼠分别连续灌胃给予14天或3个月(至11月龄，相当于中晚期ad)oab-1450、100和200mg/kg，以多奈哌齐做阳性对照药。结果显示，不论是连续14天给药，还是连续3个月给药，oab-14均能剂量依赖性地改善模型动物在新物体辨别实验、y-迷宫实验、morris水迷宫实验、筑巢实验及社交活动实验中多种学习记忆障碍，提高认知功能、社会交往及生活自理能力，呈良好的量效关系，尤其是高剂量组明显强于多奈哌齐组，完全恢复到空白组水平。
oab-14改善app/ps1双转基因ad模型小鼠海马神经细胞病理形态异常：空白组小鼠海马ca1区神经元细胞结构清楚，排列紧密，未见异常，模型组小鼠神经元排列疏松、水肿，染色质减少，核固缩，并可见胞体、胞核淡染、甚至溶解消失，oab-14200mg/kg、100mg/kg组小鼠神经元排列紧密，未见水肿及核固缩，海马线粗细整齐。
oab-14改善app/ps1小鼠海马ca1区神经元超微结构异常：透射电镜检测发现，空白组神经元细胞核呈球形，核膜完整，核仁清楚可见，着色深；线粒体外膜及嵴清楚。模型组细胞质大量溶解丢失，可见多处核膜破损，局部核膜溶解，核内染色质聚集，粗面内质网扩张成泡；多数线粒体外膜破损及嵴部分溶解、模糊。oab-14剂量依赖性地明显改善神经细胞的超微结构，尤其是oab-14200mg/kg组，神经元细胞核轮廓清晰，核膜完整，核呈球形，核仁清楚，细胞质丰富，存在大量核糖体颗粒，粗面内质网近于正常；大多数线粒体外膜及嵴完整，仅局部溶解。
oab-14显著改善app/ps1小鼠海马突触超微结构及功能的异常：透射电镜检测结果显示，空白组海马突触前后膜结构清晰可见，前膜内突触囊泡数量较多且清晰可见，突触后膜有深染的致密斑；与空白组相比，模型组小鼠海马ca1区突触的数量减少，可见多数突触间隙狭窄，突触前后膜融合，前膜囊泡减少，部分突触后膜突触后致密物密度降低；免疫印迹实验显示，syp、psd95、gap43等突触相关蛋白表达显著减少。膜片钳实验显示，代表突触功能的ltp显著降低。oab-14100mg/kg、200mg/kg剂量组明显改善突触超微结构。表现为突触间隙清晰可见，突触前膜内有较多突触囊泡，突触前后膜清晰均匀，突触后致密斑深染；syp、psd95、gap43等突触相关蛋白表达显著增加；ltp显著增强。
安全性初步评价：按5000mg/kgoab-14剂量给小鼠灌胃摸索其ld50实验，未见小鼠肉眼可见的不良反应，小鼠状态良好、没有小鼠死亡，心、肝、脾、肾等脏器检查未见异常。在连续3个月给药改善学习记忆的行为学实验中，oab-14的低、中、高剂量组的所有实验小鼠，状态良好、毛发光亮、柔顺，心、肝、脾、肾等脏器指数未见异常。
水迷宫定向航行实验：
与空白对照组相比，模型组小鼠第二天训练的逃避潜伏期显著增加，第三天、第四天训练的逃避潜伏期和游泳总路程均显著增加；与模型组相比，oab-14200mg/kg组从第二天开始逃避潜伏期显著降低，从第三天开始游泳总路程显著降低，贝沙罗汀组及oab-14100mg/kg组第三天、第四天逃避潜伏期显著降低，oab-14100mg/kg组第四天游泳总路程显著降低。
上述实验结果提示，oab-14对app/ps1小鼠空间学习记忆障碍有显著的改善作用。
探索实验结果：
实验结果表明，与空白对照组相比，模型组小鼠探索实验实验目标象限游泳时间、目标象限游泳路程百分率及穿台次数均显著降低；与模型组相比，贝沙罗汀组、oab-14200mg/kg组、oab-14100mg/kg组目标象限游泳时间、目标象限游泳路程百分率及穿台次数均显著增加。
社会交往实验：
实验结果显示，与对照组相比，模型组小鼠主动接触时间显著降低；与模型组相比，oab-14200mg/kg剂量组小鼠主动接触时间显著增加。
筑巢实验：
实验结果显示，与对照组相比，模型组小鼠12h、24h筑巢能力显著降低；与模型组相比，oab-14200mg/kg剂量组小鼠6h、12h、24h筑巢能力显著增加，贝沙罗汀100mg/kg，多奈哌齐1.3mg/kg，oab-14100mg/kg剂量组小鼠12h筑巢能力显著增加。
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