一种快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物、试剂及方法与流程

本发明涉及病毒基因分型的方法，具体涉及一种快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物和方法。

背景技术：

登革病毒（dengue virus,DV)为有包膜的单股正链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒，其主要传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊，在我国主要为白纹伊蚊。它是引起人类登革热（dengue fever,DF）、登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征（dengue shock syndrome,DSS）的主要病原。1779年，在印度尼西亚雅加达，Bylon首先记述了这种被称为关节热的疾病，1869年由英国伦敦皇家内科学院将此病命名为登革热。登革热和登革出血热广泛流行于全球热带和亚热带地区的60多个国家和地区,特别是东南亚、太平洋岛屿及加勒比海地区,在欧洲和北美也发生过由输入性病例引起的小范围感染流行。20世纪,登革热在世界各地发生过多次大流行，病例数达百万，全球大约有25亿人口受到登革病毒感染的威胁，每年约有5000万到一亿人感染登革病毒，50万人需入院治疗，约24000人死亡。在我国流行广泛的地区有广东、广西、海南、辽宁等地,流行季节海南为4～6月，广东和广西为8月。早在1873年，我国厦门曾发生过登革热。1928～1929年，在广州、厦门、杭州、宁波、上海、台湾和香港等地流行。1940年，本病在上海至南通广大地区流行。1942～1945年，本病流行更加严重，不仅流行于沿海地区，甚至蔓延到内地如汉口等地。1978年5月广东佛山市石湾镇首先发生登革热，疫情迅速向四周蔓延。2002年夏天广州出现登革热流行，有1000多人发病。自2014年6月起，广东省发生了大范围的登革热爆发性流行，截止到11月中旬，广东全省登革热发病例已突破4万4千例，报告死亡病例6例。在台湾省高雄市，截止到2014年11月中旬，年度登革热发病例也突破1万例，报告死亡病例15例。2015年截止到11月03日，台湾省共报告登革热病例数29921例，其中台南市达21874例，高雄市7521例，屏东县151例，其余县市均为移入地散发病情，目前累计死亡人数为129人，27例疑似死亡病例待审(台南9例、高雄17例、屏东县1例)，台湾仍有28人于加护病房治疗中。在中国大陆，截止到2015年10月17日，广东潮州市共报告登革热病例1273例。

以上资料显示，近年来，登革热在我国亚热带及热带地区几乎每年都有爆发性大范围流行，在当地形成严重的社会公共卫生问题。

登革病毒可分为四个抗原性密切相关的血清型,即登革1、2、3、4型。各型登革病毒之间核苷酸序列的同源性为63%-68%,同一血清型各病毒株之间核苷酸序列的同源性大于95%。4个血清型均可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。DV感染机体后可呈现两种不同的状态,即原发感染状态和继发感染状态。机体初次感染登革病毒后,可表现为隐性感染或一般的发热,症状不明显，同时对同型病毒产生免疫力,而且可能持续终生,但对异型病毒感染的保护作用持续时间较短。在第二次感染异型DV的患者中容易发生DHF和DSS,且病死率较高,其发病机制是依赖抗体增强的感染作用。区分这两种状态对于临床治疗非常重要。由于目前还没有成功的疫苗可以使用,也没有特效的治疗药物，因此登革病毒感染的早期诊断以及分型,对于病例的临床治疗以及疾病监测,流行病学调查和疾病控制措施的开展有非常重要的意义。

在登革病毒感染实验室诊断方法上,血清学试验和分子生物学的研究已经取得一定的进展。登革病毒的鉴定及分型,传统的方法主要有病毒分离与鉴定、血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验等。敏感细胞培养或动物分离病毒仍然是诊断的“金标准”，但这种方法很费时，且很多实验室缺少开展病毒分离所必备的条件。另一方面，病毒特异性抗体在发病3～5天后才能检测到,血清学早期检测灵敏度不高，且特异性差、操作繁琐、耗时,尤其是难以准确分型。随着各型登革病毒单克隆抗体的研制成功, 基于登革病毒型特异性单克隆抗体的分型鉴定方法,如间接免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附技术(ELISA)广泛应用于全球各个登革病毒检测实验室, 登革病毒的准确分型问题得到解决,但仍存在与其它黄病毒交叉反应问题,且耗时、成本高、操作复杂。1990年,Deubel等首次报道了应用PCR技术检测登革病毒核酸。1992年，Lanciotti等设计一套巢式PCR引物，利用各型登革病毒PCR扩增产物大小的不同来分型。此后的十多年时间内,中外文献上出现了很多关于应用PCR技术检测登革病毒的报道,从多管两步法到单管一步法，从四对型特异性引物分别反应到单管多重反应，但仍存在需要多对引物、电泳检测环节易污染而导致假阳性等问题。荧光PCR虽然不易污染，但需要多对引物探针，价格昂贵，从而不能广泛应用。

上述方法均未能克服操作复杂、费时、费用高、可靠性差等缺点，在临床实践中的应用受限。因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的登革病毒血清型分型方法。

技术实现要素：

为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠且检测成本低廉，有利于在临床实践中推广应用。

本发明的目的在于提供三组快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物。

本发明的另一目的在于提供一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM方法。

本发明的再一目的在于提供一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM试剂。

本发明所采取的技术方案是：

碱基位点在快速区分不同血清型登革病毒中的应用，所述碱基位点为：

Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；

Genbank编号为AF038403.1 的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；

Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；

Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A。

基因片段在快速区分不同血清型登革病毒中的应用，所述基因片段为：

67bp的基因片段：

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAG-3’（SEQ ID NO：171）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：172）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：173）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAACATCAATCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：174）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTGCAACATCAATCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：175）；

45bp的基因片段：

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：176）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：177）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：178）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：179）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：180）。

一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物，所述引物扩增出来的目的基因片段中含有以下碱基位点：

Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；

Genbank编号为AF038403.1 的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；

Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；

Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A。

一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物，所述引物包括引物P1、P2和P3；

引物P1的碱基序列选自SEQ ID NO：1～68中的至少一种；

引物P2的碱基序列选自SEQ ID NO：69～96中的至少一种；

引物P3的碱基序列选自SEQ ID NO：97～170中的至少一种。

一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物，所述引物包括引物P1、P2和P3；

引物P1的碱基序列选自SEQ ID NO：1～20中的至少一种；

引物P2的碱基序列选自SEQ ID NO：69～80中的至少一种；

引物P3的碱基序列选自SEQ ID NO：97～120中的至少一种。

一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物，所述引物包括引物P1、P2和P3；

引物P1的碱基序列选自SEQ ID NO：1～4中的至少一种；

引物P2的碱基序列选自SEQ ID NO：69～71中的至少一种；

引物P3的碱基序列选自SEQ ID NO：99～101中的至少一种。

一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM试剂，该试剂含有上述所述的引物P1、P2和P3。

一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM方法，包括以下步骤：

1）模板的制备：从样品中提取病毒RNA作为模板，或将该RNA反转录出cDNA作为模板，或构建含有HRM分型片段的质粒作为模板；

2）以提取的RNA为模板，用上述所述的引物对P1、P2进行RT-PCR反应；或者以步骤1）中所述的cDNA或质粒为模板，用上述所述的引物对P1、P2进行PCR反应；

3）以阳性对照品为参照，对扩增产物进行HRM分析；

若样品的熔解温度与DV4阳性对照品一致，则判定为DV4；

若样品的熔解温度与DV2阳性对照品一致，则判定为DV2；

若样品的熔解温度与DV3阳性对照品一致，则判定为DV3；

若样品的熔解温度与DV1或DV4标准株的阳性对照品一致，则判定为DV1或DV4标准株；

4）DV1和DV4标准株的区分：

重复步骤2）的操作，除了将其中的引用P1和P2替换为上述所述的引物对P1、P3，其他操作不变；以阳性对照品为参照，对扩增产物进行HRM分析；

若样品的熔解温度与DV1阳性对照品一致，则判定为DV1；

若样品的熔解温度与DV4标准株阳性对照品一致，则判定为DV4标准株。

进一步的，步骤2）中所述RT-PCR的反应体系为：

RNA模板 2μl

10μmol引物P1 0.4μl

10μmol引物P2或P3 0.4μl

TaKaRa Ex Taq HS 0.4μl

PrimeScript RT enzyme Mix II 0.4μl

2X One Step RT-PCR Buffer III 10μl

LC green 染料 0.5μl

RNase Free ddH2O 补至20μl。

进一步的，步骤2）中所述PCR的反应体系为：

Premix Taq™ 25μl

质粒模板 2μl

10μmol上游引物P1 0.5μl

10μmol下游引物P2/P3 0.5μl

LC green染料 0.5μl

ddH2O 补至50μl。

进一步的，步骤2）中所述RT-PCR的反应程序为：42℃ 30min；94℃预变性2min；94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸8min。

进一步的，所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53～55℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min。

本发明的有益效果是：

1）本发明首次建立了一种快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物和方法，利用本发明的引物和方法能简便的鉴别登革病毒四种血清型。

2）本发明操作简单：只需RT-PCR或PCR-HRM反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需2～3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，每个样品的饱和染料成本为1 RMB；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

3）本发明的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物通用性好，对4种血清型的登革病毒均有很好的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。

4）本发明的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物特异性好，除可以与4种血清型的登革病毒结合，不与其他常见黄病毒类病毒RNA结合，特异性扩增登革病毒RNA，有利于提高本发明对血清型分析的正确性。

附图说明

图1是四种血清型DV细胞培养液上清67bp RT-PCR产物电泳图；

图2是四种血清型DV细胞培养液上清67bp RT-PCR产物标准化熔解曲线图；

图3是四种血清型DV细胞培养液上清67bp RT-PCR产物峰型化熔解曲线图；

图4是分别含DV1、DV2、DV3、DV4及DV4标准株中目的基因的质粒的67bp PCR产物的电泳图；

图5是分别含DV1、DV2、DV3、DV4及DV4标准株中目的基因的质粒的67bp PCR产物标准化熔解曲线图；

图6是分别含DV1、DV2、DV3、DV4及DV4标准株中目的基因的质粒的67bp PCR产物峰型化熔解曲线图；

图7是分别含DV1、DV4标准株中目的基因的质粒的45bp PCR产物的电泳图；

图8是分别含DV1、DV4标准株中目的基因的质粒的45bp PCR产物标准化熔解曲线图；

图9是分别含DV1、DV4标准株中目的基因的质粒的45bp PCR产物峰型化熔解曲线图；

图10是含DV1 中280bp目的基因的质粒测序结果中67bp的分型序列；

图11是含DV2 中280bp目的基因的质粒测序结果中67bp的分型序列；

图12是含DV3 中280bp目的基因的质粒测序结果中67bp的分型序列；

图13是含DV4 中280bp目的基因的质粒测序结果中67bp的分型序列；

图14是立菲生物合成的含DV4标准株中280bp质粒测序结果中67bp的分型序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1：快速区分不同血清型登革病毒的碱基位点和基因片段

（1）本发明经过大量实验研究，发现以下碱基位点可用于快速区分不同血清型登革病毒：Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；

Genbank编号为AF038403.1 的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；

Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；

Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A。

（2）本发明经过进一步的实验研究，发现以下基因片段可用于快速区分不同血清型登革病毒：

67bp的基因片段：

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAG-3’（SEQ ID NO：171）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：172）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCCTCAGCATCATTCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：173）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAACATCAATCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：174）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTGCAACATCAATCCAGGCACAG-3’ （SEQ ID NO：175）；

45bp的基因片段：

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：176）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：177）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：178）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：179）；

5’-AAACAGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTGTCTC-3’（SEQ ID NO：180）。

实施例2 快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物

本发明经过对所设计的大量引物进行实验筛选后，发现可用于快速区分不同血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物，所述引物扩增出来的目的片段中含有以下碱基位点：

Genbank编号为EU848545.1的DV1标准株基因组中第10648位碱基G，第10671位碱基T，第10672位碱基A，第10675位碱基G；

Genbank编号为AF038403.1 的DV2标准株基因组中第10638位碱基A，第10661位碱基C，第10662位碱基T，第10665位碱基G；

Genbank编号为M93130.1的DV3标准株基因组中第10610位碱基G，第10633位碱基C，第10634位碱基T，第10637位碱基G；

Genbank编号为AY947539.1的DV4标准株基因组中第10570位碱基A，第10593位碱基T，第10594位碱基G，第10597位碱基A。

进一步通过实验筛选，发现引物P1、P2、P3的联合使用对RT-PCR-HRM方法区分四种血清型登革病毒的效果最好。

其中，引物P1的碱基序列选自SEQ ID NO：1～68中的至少一种。

引物P2的碱基序列选自SEQ ID NO：69～96中的至少一种。

引物P3的碱基序列选自SEQ ID NO：97～170中的至少一种。

实施例3：一种快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM的方法

1）DV中RNA的提取：

临床分离的登革病毒细胞培养液上清由广州市第八人民医院提供。用天根病毒DNA/RNA提取试剂盒（OSR-M202），在TGuide M16自动核酸提取仪上分别提取临床上分离得到的四种血清型登革病毒细胞培养液上清中的登革病毒RNA，作为后续一步法RT-PCR的模板。

2）一步法RT-PCR：

利用Takara One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒，内含TaKaRa Ex Taq HS，PrimeScript RT enzyme Mix II，2X One Step RT-PCR Buffer III等。20μl的体系：RNA模板根据实际浓度加入5μl之内的量，一般为2μl。TaKaRa Ex Taq HS加0.4μl，上下游引物各加0.4μl，PrimeScript RT enzyme Mix II加0.4μl，2X One Step RT-PCR Buffer III 10μl,LC green 染料加入0.5μl。用RNase Free ddH2O补至20μl。

本实施例中具体的反应体系为：

RNA模板 2μl

10μmol引物P1 0.4μl

10μmol引物P2 0.4μl

TaKaRa Ex Taq HS 0.4μl

PrimeScript RT enzyme Mix II 0.4μl

2X One Step RT-PCR Buffer III 10μl

LC green 染料 0.5μl

RNase Free ddH2O 补至20μl。

上述引物P1的序列为5’-AAACAGCATATTGACGCTGG-3’(SEQ ID NO:3)；

引物P2的序列为5’- CTGTGCCTGGAATGATG -3’(SEQ ID NO:69)。

RT-PCR反应程序是：42℃ 30min；94℃预变性2min；94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃终延伸8min，扩增产物在Rotor-Gene Q仪器上进行分析。

3）结果分析：

电泳检测：上述RT-PCR产物的电泳图见图1，从图1中可以看出，本实施例中临床上得到的四种血清型登革病毒都能被扩增出67bp的基因片段，并进行测序（由上海生工生物工程有限公司完成），测序结果显示，DV1（登革病毒1型）、DV2（登革病毒2型）、DV3（登革病毒3型）的67bp片段均与相应的标准株一致，而本实施例选用的DV4（登革病毒4型）的67bp片段与DV4标准株存在一个碱基突变（67bp片段的第47位碱基G突变成了A），即SEQ ID NO：174与SEQ ID NO：175中第47位碱基存在碱基突变。

HRM分析：

对上述RT-PCR产物均在Rotor-Gene Q仪器上进行HRM（高分辨率熔解曲线分析技术）分析，分析结果见图2和图3。

图2是四种血清型DV细胞培养液上清67bp RT- PCR产物标准化熔解曲线图；从中可以看出DV1、DV2、DV3和DV4熔解曲线相互分开，表明所设计引物P1和P2适合用于该4种血清型DV的HRM分析，能够区分四种血清型的登革病毒。

图3是四种血清型DV细胞培养液上清67bp RT-PCR产物峰型化熔解曲线图；从中可以看出DV1、DV2、DV3和DV4的熔解温度（Tm）均不同，DV4的熔解温度最低为76.9℃，DV1、DV2、DV3的熔解温度依次为77.6℃、77.9℃和78.16℃。

实施例4：一种快速区分四种血清型登革病毒的PCR-HRM的方法

为了进一步分析引物P1、P2是否能够区分开DV1、DV2、DV3、DV4、DV4标准株，本实施例构建了包含67bp及45bp分型片段的280bp质粒，并另外增加了一份人工合成基因片段的质粒样品（DV4标准株280bp片段，包含67bp及45bp分型片段，克隆于puc57质粒中，由上海立菲生物技术有限公司合成）。

1）含DV 280bp目的基因的质粒样品的制备：

以上游引物5’-GCWGCCTGTAGCTCC-3’（SEQ ID NO：181），下游引物5’-CTGTGCCTGGAATGATG-3’ （SEQ ID NO：182）扩增登革病毒基因的280bp片段（包含67bp及45bp HRM分型片段），纯化回收PCR产物，与Takara pMD-18T vector连接。

载体连接反应体系（10μl）：

反应条件：16℃，4h以上。

取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5µl，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。加入400µl LB液体培养基，37℃200r/min-220r/min振荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。4℃4000r/min离心5min，弃去上清400µl，将剩余的100µl菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h～16h，至单菌落出现。用灭菌牙签挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃200r/min-220r/min振荡培养12h～16h，经菌液PCR鉴定为阳性。

2）质粒的抽提：

用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒分别提取DV1、DV2、DV3、DV4 、DV4标准株的质粒。

3）PCR扩增：

DV1、DV2、DV3、DV4 、DV4标准株质粒的PCR扩增体系为：

Premix Taq™(TaKaRa Taq™ Version 2.0) 25μl

质粒模板 2μl

10μmol上游引物P1 0.5μl

10μmol下游引物P2 0.5μl

LC green染料 0.5μl

ddH2O 补至50μl。

上述引物P1的序列为5’-AAACAGCATATTGACGCTGG-3’(SEQ ID NO:3)；

引物P2的序列为5’- CTGTGCCTGGAATGATG -3’(SEQ ID NO:69)。

PCR反应程序：

94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s(下游引物为P2时；下游引物为P3时退火温度为55℃)，72℃延伸30s；循环35次；72℃终延伸8min。

4）结果分析：

电泳检测：上述PCR扩增产物的电泳图见图4，从图4中可以看出，本实施例中所有样品都能被扩增出67bp的基因片段。对构建的280bp质粒进行测序（由上海生工生物工程有限公司完成），测序结果均正确。

HRM分析：对上述PCR产物均在Rotor-Gene Q仪器上进行HRM（高分辨熔解曲线分析技术）分析，分析结果见图5和图6。

图5是四种血清型DV质粒及人工合成的DV4标准株质粒的67bp PCR产物标准化熔解曲线图；从中可以看出，DV2、DV3、DV4的标准化熔解曲线可以很好地区分开，但DV1和DV4标准株的曲线混合在一起，不能被有效区分。

图6是四种血清型DV质粒及人工合成的DV4标准株质粒的67bp PCR产物峰型化熔解曲线图；同图5，DV2、DV3、DV4的峰型化熔解曲线可以很好地区分开，DV4的熔解温度为79.29±0.028℃，DV2的熔解温度为80.52±0.027℃，DV3的熔解温度为80.93±0.025℃，DV1或DV4标准株的熔解温度为80.26±0.038℃，但DV1和DV4标准株的曲线混合在一起，不能被有效区分。

5）DV1和DV4标准株的区分：

将DV1和DV4标准株的质粒分别进行PCR扩增，除了所用的引物为P1和P3，其他操作均同上述步骤2）；

上述引物P1的序列为5’-AAACAGCATATTGACGCTGG-3’(SEQ ID NO:3)；

引物P3的序列为5’-GAGACAGCAGGATCTCTG-3’(SEQ ID NO:101)；

电泳检测：上述PCR扩增产物的电泳图见图7，从图7中可以看出，DV1和DV4标准株样品都能被扩增出45bp的基因片段。并对扩增出来的基因片段分别进行测序（由上海生工生物工程有限公司完成），测序结果均正确。

HRM分析：对上述PCR产物均在Rotor-Gene Q仪器上进行HRM（高分辨熔解曲线分析技术）分析，分析结果见图8和图9。

图8是DV1、DV4标准株质粒的45bp PCR产物标准化熔解曲线图；从中可以看出DV1和DV4标准株熔解曲线相互分开，表明所设计引物P1和P3适合用于该2种血清型DV（DV1和DV4）的HRM分析。

图9是DV1、DV4标准株质粒的45bp PCR产物峰型化熔解曲线图；从中可以看出DV1和DV4标准株的熔解温度（Tm）不同，DV4标准株的熔解温度为76.13±0.023℃，DV1的熔解温度为76.77±0.031℃，可被很好地区分开。

图10是DV1中280bp碱基片段测序结果中相应67bp碱基的分型序列测序图；

图11是DV2中280bp碱基片段测序结果中相应67bp碱基的分型序列测序图（测序图为反向互补序列）；

图12是DV3中280bp碱基片段测序结果中相应67bp碱基的分型序列测序图；

图13是DV4中280bp碱基片段测序结果中相应67bp碱基的分型序列测序图；

图14是立菲生物合成的DV4标准株的280bp碱基片段中相应67bp碱基的分型序列测序图。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 广东省实验动物监测所 广州市第八人民医院

<120>一种快速区分四种血清型登革病毒的RT-PCR-HRM或PCR-HRM引物、试剂及方法

<160> 182

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

aaacagcata ttgacgctgg ga 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

aaacagcata ttgacgctgg g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

aaacagcata ttgacgctgg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

aaacagcata ttgacgctg 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

aaacagcata ttgacgct 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

aaacagcata ttgacgc 17

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 7

aaacagcata ttgacg 16

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<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 8

aaacagcata ttgac 15

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 9

aaacagcata ttga 14

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 10

aacagcatat tgacgctggg a 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 11

acagcatatt gacgctggga 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 12

cagcatattg acgctggga 19

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 13

agcatattga cgctggga 18

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 14

gcatattgac gctggga 17

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<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 15

catattgacg ctggga 16

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 16

atattgacgc tggga 15

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 17

tattgacgct ggga 14

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 18

aacagcatat tgacgctggg 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 19

aacagcatat tgacgctgg 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 20

aacagcatat tgacgctg 18

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 21

aacagcatat tgacgct 17

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 22

aacagcatat tgacgc 16

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 23

aacagcatat tgacg 15

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<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 24

aacagcatat tgac 14

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 25

aacagcatat tga 13

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<212> DNA

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<400> 26

aacagcatat tg 12

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 27

acagcatatt gacgctggg 19

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 28

acagcatatt gacgctgg 18

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 29

acagcatatt gacgctg 17

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 30

acagcatatt gacgct 16

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 31

acagcatatt gacgc 15

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 32

acagcatatt gacg 14

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<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 33

acagcatatt gac 13

<210> 34

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 34

acagcatatt ga 12

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 35

acagcatatt g11

<210> 36

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 36

cagcatattg acgctggg 18

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 37

cagcatattg acgctgg 17

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 38

cagcatattg acgctg 16

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 39

cagcatattg acgct 15

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 40

cagcatattg acgc 14

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 41

cagcatattg acg 13

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<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 42

cagcatattg ac 12

<210> 43

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 43

cagcatattg a11

<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 44

agcatattga cgctggg 17

<210> 45

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 45

agcatattga cgctgg 16

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<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 46

agcatattga cgctg 15

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<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 47

agcatattga cgct 14

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<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 48

agcatattga cgc 13

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<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 49

agcatattga cg 12

<210> 50

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 50

agcatattga c11

<210> 51

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 51

gcatattgac gctggg 16

<210> 52

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 52

gcatattgac gctgg 15

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 53

gcatattgac gctg 14

<210> 54

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 54

gcatattgac gct 13

<210> 55

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 55

gcatattgac gc 12

<210> 56

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 56

gcatattgac g11

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<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 57

catattgacg ctggg 15

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<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 58

catattgacg ctgg 14

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<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 59

catattgacg ctg 13

<210> 60

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 60

catattgacg ct 12

<210> 61

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 61

catattgacg c11

<210> 62

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 62

atattgacgc tggg 14

<210> 63

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 63

atattgacgc tgg 13

<210> 64

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 64

atattgacgc tg 12

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<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 65

atattgacgc t11

<210> 66

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 66

tattgacgct ggg 13

<210> 67

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 67

attgacgctg gg 12

<210> 68

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 68

ttgacgctgg g11

<210> 69

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<212> DNA

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<400> 69

ctgtgcctgg aatgatg 17

<210> 70

<211> 16

<212> DNA

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<400> 70

ctgtgcctgg aatgat 16

<210> 71

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 71

ctgtgcctgg aatga 15

<210> 72

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 72

ctgtgcctgg aatg 14

<210> 73

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 73

ctgtgcctgg aat 13

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<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 74

ctgtgcctgg aa 12

<210> 75

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 75

ctgtgcctgg a11

<210> 76

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 76

tgtgcctgga atgatg 16

<210> 77

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 77

gtgcctggaa tgatg 15

<210> 78

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 78

tgcctggaat gatg 14

<210> 79

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 79

gcctggaatg atg 13

<210> 80

<211> 12

<212> DNA

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<400> 80

cctggaatga tg 12

<210> 81

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 81

ctggaatgat g11

<210> 82

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 82

tgtgcctgga atgat 15

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<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 83

tgtgcctgga atga 14

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<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 84

tgtgcctgga atg 13

<210> 85

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 85

tgtgcctgga at 12

<210> 86

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 86

tgtgcctgga a11

<210> 87

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 87

gtgcctggaa tgat 14

<210> 88

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 88

gtgcctggaa tga 13

<210> 89

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 89

gtgcctggaa tg 12

<210> 90

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 90

gtgcctggaa t11

<210> 91

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 91

tgcctggaat gat 13

<210> 92

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 92

tgcctggaat ga 12

<210> 93

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 93

tgcctggaat g11

<210> 94

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 94

gcctggaatg at 12

<210> 95

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 95

cctggaatga t11

<210> 96

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 96

gcctggaatg a11

<210> 97

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 97

gagacagcag gatctctggt ct 22

<210> 98

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 98

gagacagcag gatctctggt c 21

<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 99

gagacagcag gatctctggt 20

<210> 100

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 100

gagacagcag gatctctgg 19

<210> 101

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 101

gagacagcag gatctctg 18

<210> 102

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 102

gagacagcag gatctct 17

<210> 103

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 103

gagacagcag gatctc 16

<210> 104

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 104

gagacagcag gatct 15

<210> 105

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 105

gagacagcag gatc 14

<210> 106

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 106

gagacagcag gat 13

<210> 107

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 107

agacagcagg atctctggtc t 21

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 108

gacagcagga tctctggtct 20

<210> 109

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 109

acagcaggat ctctggtct 19

<210> 110

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 110

cagcaggatc tctggtct 18

<210> 111

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 111

agcaggatct ctggtct 17

<210> 112

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 112

gcaggatctc tggtct 16

<210> 113

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 113

caggatctct ggtct 15

<210> 114

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 114

aggatctctg gtct 14

<210> 115

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 115

ggatctctgg tct 13

<210> 116

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 116

gatctctggt ct 12

<210> 117

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 117

agacagcagg atctctggtc 20

<210> 118

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 118

agacagcagg atctctggt 19

<210> 119

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 119

agacagcagg atctctgg 18

<210> 120

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 120

agacagcagg atctctg 17

<210> 121

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 121

agacagcagg atctct 16

<210> 122

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 122

agacagcagg atctc 15

<210> 123

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 123

agacagcagg atct 14

<210> 124

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 124

agacagcagg atc 13

<210> 125

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 125

agacagcagg at 12

<210> 126

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 126

agacagcagg a11

<210> 127

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 127

gacagcagga tctctggtc 19

<210> 128

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 128

gacagcagga tctctggt 18

<210> 129

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 129

gacagcagga tctctgg 17

<210> 130

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 130

gacagcagga tctctg 16

<210> 131

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 131

gacagcagga tctct 15

<210> 132

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 132

gacagcagga tctc 14

<210> 133

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 133

gacagcagga tct 13

<210> 134

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 134

gacagcagga tc 12

<210> 135

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 135

gacagcagga t11

<210> 136

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 136

acagcaggat ctctggtc 18

<210> 137

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 137

acagcaggat ctctggt 17

<210> 138

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 138

acagcaggat ctctgg 16

<210> 139

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 139

acagcaggat ctctg 15

<210> 140

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 140

acagcaggat ctct 14

<210> 141

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 141

acagcaggat ctc 13

<210> 142

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 142

acagcaggat ct 12

<210> 143

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 143

acagcaggat c11

<210> 144

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 144

cagcaggatc tctggtc 17

<210> 145

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 145

cagcaggatc tctggt 16

<210> 146

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 146

cagcaggatc tctgg 15

<210> 147

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 147

cagcaggatc tctg 14

<210> 148

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 148

cagcaggatc tct 13

<210> 149

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 149

cagcaggatc tc 12

<210> 150

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 150

cagcaggatc t11

<210> 151

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 151

agcaggatct ctggtc 16

<210> 152

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 152

agcaggatct ctggt 15

<210> 153

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 153

agcaggatct ctgg 14

<210> 154

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 154

agcaggatct ctg 13

<210> 155

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 155

agcaggatct ct 12

<210> 156

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 156

agcaggatct c11

<210> 157

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 157

gcaggatctc tggtc 15

<210> 158

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 158

gcaggatctc tggt 14

<210> 159

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 159

gcaggatctc tgg 13

<210> 160

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 160

gcaggatctc tg 12

<210> 161

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 161

gcaggatctc t11

<210> 162

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 162

caggatctct ggtc 14

<210> 163

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 163

caggatctct ggt 13

<210> 164

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 164

caggatctct gg 12

<210> 165

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 165

caggatctct g11

<210> 166

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 166

aggatctctg gtc 13

<210> 167

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 167

aggatctctg gt 12

<210> 168

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 168

aggatctctg g11

<210> 169

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 169

ggatctctgg tc 12

<210> 170

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 170

gatctctggt c11

<210> 171

<211> 67

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 171

aaacagcata ttgacgctgg gagagaccag agatcctgct gtctctacag catcattcca ggcacag

<210> 172

<211> 67

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 172

aaacagcata ttgacgctgg gaaagaccag agatcctgct gtctcctcag catcattcca ggcacag

<210> 173

<211> 67

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 173

aaacagcata ttgacgctgg gagagaccag agatcctgct gtctcctcag catcattcca ggcacag

<210> 174

<211> 67

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 174

aaacagcata ttgacgctgg gaaagaccag agatcctgct gtctctacaa catcaatcca ggcacag 67

<210> 175

<211> 67

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 175

aaacagcata ttgacgctgg gaaagaccag agatcctgct gtctctgcaa catcaatcca ggcacag 67

<210> 176

<211> 45

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 176

aaacagcata ttgacgctgg gagagaccag agatcctgct gtctc 45

<210> 177

<211> 45

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 177

aaacagcata ttgacgctgg gaaagaccag agatcctgct gtctc 45

<210> 178

<211> 45

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 178

aaacagcata ttgacgctgg gagagaccag agatcctgct gtctc 45

<210> 179

<211> 45

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 179

aaacagcata ttgacgctgg gaaagaccag agatcctgct gtctc 45

<210> 180

<211> 45

<212> DNA

<213> 登革病毒

<400> 180

aaacagcata ttgacgctgg gaaagaccag agatcctgct gtctc 45

<210> 181

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 181

gcwgcctgta gctcc 15

<210> 182

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 182

ctgtgcctgg aatgatg 17