确定生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及确定生物制品中大肠杆菌dna含量的方法及试剂盒。
背景技术：
：为了确保治疗性重组dna药物的产品质量，欧美药监局和国家食品药品监督管理总局都对生物制品中宿主细胞dna残留量提出了明确要求。生物制品中原核生物dna残留量应不高于10ng/剂量，中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)dna残留量应不高于100pg/剂量。然而，如何快速、准确地检测生物制品中残留dna仍有待进一步研究和开发。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出了一种能够快速、准确且高灵敏性地检测生物制品中大肠杆菌细胞dna残留量的方法及试剂盒。在本发明的第一方面，本发明提出了一种确定生物制品中大肠杆菌dna含量的方法。该方法包括：利用大肠杆菌特异性引物组，对所述生物制品进行实时荧光定量pcr检测，以便确定所述生物制品中大肠杆菌dna含量。利用本发明实施例的方法，能够对生物制品中大肠杆菌dna的含量进行定量分析，且操作简便、耗时短、灵敏度高，对生物制品中大肠杆菌dna含量的最低检测限可达2.0fg/ul。可以为大肠杆菌细胞为宿主的生物技术药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物技术药物的研发和安全生产提供重要支持。根据本发明的实施例，上述确定生物制品中大肠杆菌dna含量的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述生物制品包括但不限于以大肠杆菌细胞为宿主的生物制品，其中包括中间过程样品、半成品、成品。根据本发明的实施例，所述大肠杆菌特异性引物组包括：正向引物，所述正向引物具有seqidno：1所示的核苷酸序列，反向引物，所用反向引物具有seqidno：2所示的核苷酸序列。agaagcttgctctttgctga(seqidno：1)。ctttggtcttgcgacgttat(seqidno：2)。发明人经过筛选实验发现，利用seqidno：1和seqidno：2所示核苷酸序列的引物组，对生物制品中大肠杆菌dna含量检测的灵敏性和特异性显著提高。根据本发明的实施例，在实时荧光定量pcr检测的反应体系中，所述正向引物的浓度为0.2～1.0微摩尔/升，优选为0.4微摩尔/升；所述反向引物的浓度为0.2～1.0微摩尔/升，优选为0.4微摩尔/升；以及所述引物组的浓度为0.4～2.0微摩尔/升，优选为0.8微摩尔/升。根据本发明的实施例，发明人经过筛选实验发现，所述引物组的浓度以及所述正向引物和所述反向引物的浓度在上述范围内，引物对模板dna的特异性结合能力显著提高，扩增产物的特异性显著提高。根据本发明的实施例，所述确定生物制品中大肠杆菌dna含量的方法进一步包括：将所述生物制品用超纯水稀释,以便获得待测样品，所述待测样品的浓度为50pg/微升～200pg/微升，优选为100pg/微升。发明人经过大量的筛选实验发现，待测样品在超纯水中的浓度高于200pg/微升，待测样品中非dna成分对实时荧光定量pcr检测造成显著干扰，所得结果的真实性和准确性显著降低，待测样品在超纯水中的浓度低于50pg/微升，则待测样品中模板dna量过低，造成荧光定量pcr检测结果重复性和准确度较差，而造成判断失误。而待测样品的浓度在100pg/微升，检测结果最接近生物样品中dna的实际含量。所述待测样品在50pg/微升～200pg/微升的浓度范围内，检测结果的准确度以及检测的灵敏度均显著提高。根据本发明的实施例，所述确定生物制品中大肠杆菌dna含量的方法还可以进一步包括：利用大肠杆菌细胞基因组dna标准品构建ct-dna量标准曲线，并将所述待测样品中大肠杆菌细胞dna的ct值与所述标准曲线对比，确定所述待测样品中大肠杆菌dna含量，其中，所述ct值是通过利用实时荧光定量pcr技术检测大肠杆菌细胞dna获得的。构建ct-dna量标准曲线以及将待测样品中大肠杆菌细胞dna的ct值与标准曲线对比来确定待测样品中大肠杆菌的含量，使得本发明实施例所提出的检测方法的稳定性和准确度显著提高。根据本发明的实施例，所述大肠杆菌细胞基因组dna标准品的浓度为2×108fg/微升、2×107fg/微升、2×106fg/微升、2×105fg/微升、2×104fg/微升、2×103fg/微升、200fg/微升、20fg/微升、2fg/微升。根据本发明的实施例，所述大肠杆菌细胞基因组dna标准品的浓度是发明人基于生物制品中大肠杆菌dna的一般含量确定的，发明人经过大量的筛选实验发现，在上述标准品的浓度范围和梯度下，所得标准曲线更加适用于确定生物制品中大肠杆菌dna的含量，进而使得本发明实施例所述提出检测方法的检测结果的准确度进一步提高。具体地，在本发明的第二方面，本发明提出了一种确定生物制品中大肠杆菌dna含量 的方法。该方法包括：(1)将所述生物制品用超纯水稀释,以便获得待测样品，所述待测样品的浓度为50pg/微升～200pg/微升，优选为100pg/微升；(2)利用实时荧光定量pcr技术确定所述待测样品中大肠杆菌细胞dna的ct值，其中所述实时荧光定量pcr技术的反应体系包括8.5微升milli-q超纯水、1微升浓度为10微摩尔/升的正向引物、1微升浓度为10微摩尔/升的反向引物、12.5微升sybrmix和2微升所述待测样品，所述正向引物具有seqidno：1所示的核苷酸序列，所述反向引物具有seqidno：2所示的核苷酸序列；其中所述实时荧光定量pcr技术的反应条件为95℃30s；95℃05s，54℃30s，72℃35s循环数40；(3)利用大肠杆菌细胞基因组dna标准品构建ct-dna量标准曲线，并将所得到的待测样品中大肠杆菌细胞dna的ct值与所述标准曲线对比，确定所述待测样品中大肠杆菌细胞dna的含量，其中，所述大肠杆菌细胞基因组dna标准品的浓度为2×108fg/微升、2×107fg/微升、2×106fg/微升、2×105fg/微升、2×104fg/微升、2×103fg/微升、200fg/微升、20fg/微升、2fg/微升。利用根据本发明实施例的方法，能够对生物制品中大肠杆菌dna的含量进行定量分析，且操作简便、耗时短、灵敏度高，对生物制品中大肠杆菌dna含量的最低检测限可达2.0fg/微升。可以为大肠杆菌细胞为宿主的生物技术药物的生产提供可靠的质控证据，为重组生物技术药物的研发和安全生产提供重要支持。在本发明的第三方面，本发明提出了实时荧光定量pcr技术在检测生物制品中大肠杆菌细胞dna含量中的用途。本发明实施例所提出的确定生物制品中大肠杆菌dna含量的方法，将实时荧光定量pcr技术应用于检测生物制品中的大肠杆菌dna含量，克服了生物制品的成分复杂易干扰实时荧光定量pcr反应的缺陷，检测结果接近生物样品中大肠杆菌dna的真实含量，检测结果准确度高，实现了对生物制品中大肠杆菌dna的实时定量分析和监控。在本发明的第四方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：正向引物，所述正向引物具有seqidno：1所示的核苷酸序列；反向引物，所述反向引物具有seqidno：2所示的核苷酸序列。利用seqidno：1和seqidno：2所示核苷酸序列的引物组，对生物制品中大肠杆菌dna含量检测的灵敏性和特异性显著提高。利用根据本发明实施例的试剂盒能够灵敏和特异性地检测生物制品中大肠杆菌dna的含量，从而实现对生物制品生产过程的质量监控。根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括大肠杆菌细胞基因组dna标准品母液，所述标准品母液的浓度为8×107fg/微升～3.0×108fg/微升，优选1.36×108fg/微升。根据本发明的实施例，利用上述标准品母液，进行梯度稀释，所获得梯度稀释后的标准品用于绘制标准曲线，所得标准曲线用于比对，进而获得的生物制品中大肠杆菌dna的含量的准确 度进一步提高。根据本发明的实施例，本发明实施例所提出的方法和试剂盒特别适用于核酸药物及其中间产物中大肠杆菌dna含量的检测。附图说明图1是根据本发明实施例的大肠杆菌基因组dna标准品的琼脂糖凝胶电泳的检测结果；图2是根据本发明实施例的大肠杆菌基因组dna的qpcr扩增曲线；图3是根据本发明实施例的cho细胞基因组dna的qpcr扩增曲线；图4是根据本发明实施例的大肠杆菌基因组dna的qpcr熔解曲线；图5是根据本发明实施例的cho细胞基因组dna的qpcr熔解曲线；以及图6是根据本发明实施例的大肠杆菌基因组dna的qpcr的ct-dna量标准曲线。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1在本实施例中，发明人对检测生物制品中大肠杆菌dna含量的方法所用材料和仪器进行介绍。实验所用材料如表1所示：表1实验所用仪器如表2所示：表2仪器与器具名称型号/规格荧光定量pcr仪steponeplus实施例2制备大肠杆菌(e.coli)定量标准品在本实施例中，发明人详细介绍了大肠杆菌(e.coli)定量标准品(基因组dna<gdna>标准品)的制备过程：a、将营养肉汤中过夜培养(37℃，200rpm)的e.coli取出，观察菌体的生长情况；b、吸取菌液，1ml/管，并于12000rpm的转速下离心1min，富集菌体；c、弃去上清液，每管加入200ulga缓冲液(来自tiangen试剂盒，cat#dp302-02)，吹打混匀，涡旋振荡数秒，彻底重悬菌体；d、每管加入4ulrna酶(rnaase)，室温放置5min，再向每管中加入20ul蛋白酶k(proteinasek)，混匀；加入200ulgb缓冲液(来自tiangen试剂盒，cat#dp302-02)(产生大量白色絮状沉淀)，混匀，70℃混匀10min，至白色絮状沉淀完全消失，溶液变得清亮；e、每管加入220ul预冷无水乙醇(此步骤可能产生少量白色絮状沉淀)，将上述每管溶液全部转移至吸附管，并于12000rpm转速下离心1min；f、弃去收集管中废液，向吸附柱中加入500ulpw漂洗液(来自tiangen试剂盒，cat#dp302-02)，并于12000rpm转速下离心1min；g、重复步骤f；h、空管在12000rpm转速下离心1min；i、将吸附柱放至新ep离心管中，室温放置5～10min，彻底晾干柱内残余乙醇；j、向每管吸附柱膜中间位置悬空滴加50ul预热注射用水，室温放置5～10min，12000rpm，2min；k、收集离心后基因组dna，并进行琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，鉴定结果如图1所示；l、采用紫外分光光度法(260nm/280nm的紫外波长)检测和琼脂糖凝胶电泳法检测基因组dna的含量和纯度后，进行分装，-80℃保存。其中，采用紫外分光光度法(260nm/280nm的紫外波长)对基因组dna的含量和纯度的检测结果表3所示。表3表3结果表明，提取制备的大肠杆菌定量标准品浓度为136微克/ml(136ng/微升)，纯度为1.9(标准规定应为1.8～2.0)，可用于生物制品中宿主dna含量检测。实施例3实时荧光定量pcr技术(qpcr)检测e.coli宿主dna残留量在本实施例中，发明人详细介绍了利用qpcr检测e.coli宿主dna含量的过程和条件：1)将实施例2已提取制备好的e.coli基因组dna(gdna)母液(136ng/微升)依次系列梯度稀释至20ng/微升、2ng/微升、200pg/微升、20pg/微升、2pg/微升、200fg/微升、20fg/微升、2fg/微升，以绘制ct-dna量标准曲线。2)灭菌超纯水(ntc)：分装后-20℃冻存，按需取用。3)反应体系的制备，根据反应数量配制体系(微升)，反应体系如表4所示：表4water8.510um正向引物110um反向引物12xsybr混合物12.5dna模板2总体积254)仪器设置及运行(1)选择标准曲线/sybergreen/标准试剂，设置反应孔板：包括标准系列、检测样以及对照。设置反应条件：3步法95℃30s；95℃05s，54℃30s，72℃35s循环数40，反应体系25μl。熔解曲线65℃～95℃，每上升0.2℃，仪器读数一次。(2)运行程序，参照qpcr仪sop。(3)分析：分析设置，自动ct/自动基线(根据标准曲线图适当调整分析参数)，设置 好标准点定量值、样品名称和96孔板间布局等信息，其他设置不变，运行分析，系统会根据定量值进行自动分析，计算出样品大肠杆菌宿主dna残留量。并核实斜率、扩增效率、截距、r2值，从而检测每个样品的均值、标准差sd。其中，大肠杆菌基因组dna扩增曲线(amplificationplot)如图2所示，图2结果显示：大肠杆菌细胞基因组扩增曲线呈现典型s型，且特异性扩增产物的熔解温度tm值为83.91℃(图中横坐标代表扩增循环数cycle,图例(legend)中a代表20ng/微升、b代表2ng/微升、c代表200pg/微升、d代表20pg/微升、e代表2pg/微升、f代表200fg/微升、g代表20fg/微升、h代表2fg/微升)。cho细胞基因组dna的扩增曲线如图3所示，图3结果显示：样品含有cho细胞基因组，依然没有观察到本发明的方法受到干扰，说明该方法的专属性良好。大肠杆菌基因组dna的qpcr熔解曲线(meltcurve)如图4所示(图中横坐标代表温度temperature,纵坐标代表荧光强度负导值，图例legend中a代表20ng/微升、b代表2ng/微升、c代表200pg/微升、d代表20pg/微升、e代表2pg/微升、f代表200fg/微升、g代表20fg/微升、h代表2fg/微升)。cho细胞基因组dna的熔解曲线如图5所示，结果显示，本发明的方法的专属性良好。另外，利用大肠杆菌标准品测定的ct值如表5所示：表5分析表5可以看出：随着稀释梯度的升高，定量反应各标准点ct值呈现规律性递增趋势，且各标准曲线ct值相对偏差rsd均小于15％，符合可接受标准。进而，可得大肠杆菌基因组的qpcr的标准曲线(ct-dna量标准曲线standardcurve)，曲线如图6所示，线性方程为y＝-3.32x+36.082。实施例4实时荧光定量pcr技术(qpcr)检测e.coli宿主dna含量方法的系统适用性检测在本实施例中，发明人对利用qpcr检测e.coli宿主dna含量方法的系统适用性进行了评估，在评估过程中，发明人在实施例3所述的qpcr的检测条件下对大肠杆菌(e.coli)标准品进行检测，进而评估该检测方法的系统适用性。其中，qpcr可接受的检测标准为：线性相关系数：r≧0.99,扩增效率：90.0％≤eff％(扩增效率)≤105.0％,斜率：-3.0≤slop(斜率)≤-3.6,ntc的ct值不能检出或样品中大肠杆菌基因组dna低于2fg/微升，其ct值也不能检出。实验结果如表6所示：表6：表6结果表明：qpcr检测e.coli宿主dna含量方法的系统适用性符合制定的可接受标准，可用于供试品中大肠杆菌dna残留量的测定。实施例5应用在本实施例中，发明人利用实施例3所提出的方法测定供试品中大肠杆菌dna残留量，将供试品稀释至100pg/ul，测定结果如表7和表8所示。表7：供试品1原液表8：供试品2(供试品1中间过程产物)由表7和表8可以看出，供试品1原液和供试品2中，宿主细胞大肠杆菌dna残留量的测定值均小于限度值200fg，即小于质量标准规定，即每100pg样品中，dna残留量应不大于200fg，测定结果显示供试品合格。实施例6引物组的筛选在本实验中，发明人对用于检测生物制品中的大肠杆菌的引物组做了筛选实验，筛选实验中所用第一引物组的序列具有seqidno：1～2所示的核苷酸序列，筛选实验中所用第二引物组具有seqidno：3～4所示的核苷酸序列。agaagcttgctctttgctga(seqidno：1)。ctttggtcttgcgacgttat(seqidno：2)。gtctggaaaggcgcgcga(seqidno：3)。gtgtcccgccctactca(seqidno：4)。发明人经过引物组的筛选实验发现，第一引物组对生物制品中大肠杆菌dna含量检测的灵敏性和特异性高，而第二引物组无法获得理想检测结果。实施例7待测样品浓度筛选在本实施例中，发明人利用实施例3所提出的方法测定供试品中大肠杆菌dna残留量，将供试品分别稀释至1ng/ul(高本底)和1pg/ul(低本底)，考察不同本底浓度供试品测定方法的准确度，测定结果如表9和表10所示：表9：供试品1原液高本底1ng/微升表9结果表明，待测样品稀释至1ng/微升时，三组回收率试验加标回收率偏低(标准规定回收率范围应为80％～120％)，影响待测样品中大肠杆菌含量测定的准确度，因此供试品在该浓度下不适于大肠杆菌dna含量的测定。表10：供试品1原液低本底10pg/微升表10结果表明，待测样品稀释至10pg/微升时，回收率试验加标回收率偏低(标准规定回收率范围应为80％～120％)，且平行三组试验间方法的重复性较差(rsd％＞15.0％)，影响待测样品中大肠杆菌含量测定的准确度，因此供试品在该浓度下不适于大肠杆菌dna含量的测定。基于以上高本底(1ng/微升)和低本底(10pg/微升)供试品浓度的筛选结果，发明人将供试品分别进一步稀释至200pg/微升和50pg/微升，利用实施例3所提出的方法测定供试品中大肠杆菌dna残留量，进一步考察不同本底浓度的供试品对测定方法的准确度的影响，测定结果如表11和表12所示：表11：供试品1原液高本底200pg/微升表11结果表明，待测样品稀释至200pg/微升时，三组回收率试验加标回收率均符合可接受标准80％～120％，且平行三组试验重复性较好(rsd％＜15.0％)，因此供试品在该浓度下适于大肠杆菌dna含量的测定。表12：供试品1原液低本底50pg/微升表12结果表明，待测样品稀释至50pg/微升时，三组回收率试验加标回收率均符合可接受标准80％～120％，且平行三组试验重复性符合要求(rsd％＜15.0％)，因此供试品在该浓度下适于大肠杆菌dna含量的测定。通过上述实施例的研究发现，供试品浓度在50pg/微升～200pg/微升时，可实现生物制品中大肠杆菌宿主dna残留量的准确测定。综合表7、表11、表12的结果可以看出，供试品浓度在100pg/微升时，回收率最接近100％，因此供试品的浓度优选在100pg/微升，该法的准确度和重复性较好，对生物制品中大肠杆菌dna的含量进行定量分析的准确度更高。实施例8试剂盒的制备及其应用本发明的试剂盒中具有一对引物组，该引物组的正向引物具有seqidno：1所示的核苷酸序列，该引物组的反向引物具有seqidno：2所示的核苷酸序列。另外，该试剂盒的还可以进一步包括大肠杆菌细胞基因组dna标准品母液，该标准品母液可根据实施例2所述的制备方法制备，浓度为8×107fg/微升～3.0×108fg/微升，优选1.36×108fg/微升。利用本发明的试剂盒检测生物制品中大肠杆菌dna含量的操作方法可参照实施例3所述。检测结果表明，利用根据本发明的试剂盒能够灵敏和特异性地检测生物制品中大肠杆菌dna的含量。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12