技术领域本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种鉴定水稻耐铝和铝敏感品种的功能标记及应用。
背景技术：
铝是地壳中含量最高的金属元素。世界总陆地面积的30％为酸性土壤，超50％的耕地分布在酸性土壤地区。酸性土壤中的铝毒危害，一直是植物生理学家和育种工作者所关心和着力解决的热点问题。尽管水稻是禾本科小粒作物中耐铝性最强的，但是由于酸性土壤条件下的低pH环境，使得铝和铁以可溶性离子Al3+和Fe2+状态存在，导致水稻生长遭受铝毒和铁毒的危害，使根系遭受损伤，最终导致水稻产量下降，因此对水稻进行耐铝性的研究是水稻高产和稳产的关键之一。水稻在拥有大面积酸性耕地的发展中国家被广泛种植，研究其耐铝毒机制以提高水稻对铝毒的耐性，同时加大选择强耐铝的水稻种质资源，进而扩大水稻种植面积和增加水稻单产，对解决这些国家的温饱问题具有非常重要的意义。近几年有关水稻耐铝性遗传与基因控制机理研究的报道越来越多。综合这些研究来看，水稻耐铝遗传与育种研究以对水稻苗期耐铝性的研究为主，筛选到了一些耐性品种或材料，阐明了一些材料的耐性遗传模式，利用分子标记定位了多个控制耐铝性的QTLs(包括少数主效QTLs)，并且克隆了一些与水稻耐铝性相关的基因，比如：STAR1、STAR2、Nrat1、OsFRDL4、OsALS1、OsMGT1、ASR5和ART1等。特别是C2H2类型的锌指转录因子ART1，它是一个抗铝毒的转录因子，能够特异地调控水稻中耐铝毒相关基因的表达。ART1在根中呈组成性表达，且不受铝处理的影响，微阵列分析表明，ART1能够调控下游31个基因(包括STAR1,STAR2和一些在其它植物中耐铝毒基因的同源基因)转录。在水稻耐铝的研究中，都采用相对根长，特别是用最长根相对伸长量(RelativeRootElongation，RRE)作为水稻耐铝的表型指标。通过表型鉴定水稻耐铝性工作量大，耗时长。到目前为止，还未出现可以有效鉴定水稻耐铝和铝敏感品种的功能分子标记。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对上述问题，提供了一种鉴定水稻耐铝和铝敏感品种的功能标记及应用，根据水稻相关耐铝基因ART1的序列，设计高效的功能标记，对已经报道的水稻耐铝和敏感品种进行检测，证明该功能标记能够有效和可靠地鉴定水稻耐铝和敏感品种。为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鉴定水稻耐铝和铝敏感品种的功能标记，功能标记为Art1引物，其中的核苷酸正向序列为5′→3′：如SEQIDNo.1所示，反向序列为5′→3′：如SEQIDNo.2所示。本发明还公开了一种利用上述的功能标记鉴定水稻耐铝和铝敏感品种的方法，包括下述步骤：1)提取待检测水稻样本的DNA；2)利用所述Art1引物对所提取的DNA进行PCR扩增；3)对PCR扩增产物进行电泳；判断PCR产物中是否扩增出了350bp左右的目的条带；4)结果判读：如果电泳结果显示PCR产物为350bp的目的条带，则将待检测水稻样本的扩增片段、回收纯化、测序送测序公司测序；如果电泳结果显示PCR产物同时满足以下条件：a)在第185位点处的碱基为A；b)在第188位点处的碱基为G；c)在第225位点处的碱基为G；d)在第230位点处的碱基为T；e)在第258位点处的碱基为A；f)在第288位点处的碱基为G；g)在第326位点处的碱基为C；则该水稻为铝敏感品种；与铝敏感品种相比，如果电泳结果显示PCR产物同时满足以下条件：a)在第185位点处的碱基为T；b)在第188位点处的碱基为C；c)在第201位点到第224位点处有24个碱基的缺失；d)在第225位点处的碱基为A；e)在第230位点处的碱基为G；f)在第258位点处的碱基为C；g)在第288位点处的碱基为A；h)在第289位点到291位点处有3个碱基的缺失；i)在第326位点处的碱基为C；则该水稻为耐铝品种。进一步地，步骤1)中的提取的DNA260nm/280nm比值为1.7-2.0。进一步地，PCR扩增体系为：总体积为50μL，包括50-150ng模板DNA，1×PCR缓冲液，0.375μM的引物，500μMdNTP和2.5UTaq酶；所述的1×PCR缓冲液为25mMKCl，5mMTris-HClpH8.3，0.75mMMgCl2，0.01％明胶。进一步地，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，循环29次，每一个循环为：94℃，1min；60℃，1min；72℃，1min，最后72℃延伸5min。进一步地，Art1引物的正向序列如SEQIDNo.1所示，反向序列如SEQIDNo.2所示。本发明还公开了一种上述的功能标记在分子标记辅助选择耐铝水稻品种中的应用。与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：1)功能标记Art1对水稻耐铝基因ART1的扩增具有高效性和准确性。通过对ART1基因进行扩增，并选择琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果发现在5份具有耐铝性差异的水稻品种中，标记Art1的扩增片段大概为350bp；回收标记Art1在5份具有耐铝性差异的水稻品种中的扩增片段、回收纯化、测序，并对测序结果进行了比对。结果表明，利用标记Art1扩增出的序列在NCBI网站Blast结果显示：扩增的片段物理距离为3582215bp～3582575bp，而通过水稻基因注释网站RAP-DB查询到ART1基因的物理位置处于3580643bp～3582606bp之间，进一步分析发现利用标记Art1的扩增出的片段为ART1基因的部分编码区。2)功能标记Art1对水稻耐铝和铝敏感材料的鉴定具有高度准确性。2份耐铝和3份铝敏感水稻品种相比，在利用标记Art1扩增出的ART1基因的部分编码区有9处差异，其中有7处一个碱基的变异，1处24个碱基的缺失，1处3个碱基的缺失。3)功能标记Art1用于水稻辅助选择耐铝品种。利用功能标记Art1可以简单、准确、高效的检测和鉴定耐铝水稻品种。相对于最长根相对伸长量的表型观察，功能标记Art1能够更准确判断水稻品种的耐铝性，能够更有说服力的检测和鉴定耐铝水稻品种。本项目组利用标记Art1对150份丁氏水稻核心种质资源进行了鉴定，检测到了一批具有明显耐铝性的品种，并且与最长根相对伸长量的表型观察(选用RRE≥0.5作为判断是否耐铝的标准)结果相比较，两者达到了高度的一致性。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1是本发明5份具有不同耐铝性的水稻品种在ART1基因的部分编码区序列比较；其中，1为日本晴，2为Xiangnuo1，3为Xiangzhongxian2，4为南特号，5为IR64；图中黑色矩形框及两处明显缺失为2份耐铝与3份铝敏感水稻品种在利用本发明设计的标记Art1所扩增的ART1基因部分编码区的差异。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1制作功能标记引物本发明根据Yamaji等(AZincFingerTranscriptionFactorART1RegulatesMultipleGenesImplicatedinAluminumToleranceinRice,ThePlantCell,2009,21(10):3339-3349)报道的ART1的候选基因(LOC_Os12g07280)的部分序列作为模板，设计了1对功能标记Art1，核苷酸正向序列为5′→3′：ATCCTGTGCGTGAAGAACCACT(SEQIDNo.1所示)，反向序列为5′→3′：TGCCCGAATCCGAAATCC(如SEQIDNo.2所示)，扩增片段大小为350bp左右，退火温度为60℃。实施例2利用上述功能标记鉴定水稻样品是否是耐铝和铝敏感品种的方法运用功能标记Art1对已经报道的2份水稻耐铝和3份敏感品种进行检测，其中2份耐铝水稻品种分别为日本晴(Yang等，PlantPhysiology,2008,146:602–611),Xiangnuo1(Zhang等，JournalofExperimentalBotany,2007,58(8):2269-2278)。3份敏感品种分别为Xiangzhongxian2(Zhang等，JournalofExperimentalBotany,2007,58(8):2269-2278)，南特号(傅雪琳等，中国农业科学，2010，3(4):661-669)，IR64(傅雪琳等，中国农业科学，2010，43(4):661-669)。1、DNA提取：本发明首先需要对检测的样品提取DNA，对DNA提取方法没有特殊要求，CTAB、SDS等方法均可，只需提取的DNA260nm/280nm比值在1.7-2.0的范围即可。2、PCR扩增：PCR扩增反应总体积为50μL，包括50-150ng模板DNA，1×PCR缓冲液(25mMKCl，5mMTris-HClpH8.3，0.75mMMgCl2，0.01％明胶)，0.375μM的引物，500μMdNTP和2.5UTaq酶。反应在Bio-RadT100型DNA扩增仪中进行。反应程序为：94℃预变性5min，循环(94℃，1min；60℃，1min；72℃，1min)29次，最后72℃延伸5min。PCR产物存放于4℃冰箱中保存。3、电泳：对扩增后的PCR产物，取10μL用1％琼脂糖胶电泳30分钟，电压为120V，并加入标准分子量Marker，判断PCR产物中是否扩增出了350bp左右的目的条带。4、结果判读：如果电泳结果显示PCR产物为350bp的目的条带，则将Art1在5份具有耐铝性差异的水稻品种中的扩增片段、回收纯化、测序送测序公司测序，然后将测序结果在NCBI比对分析。利用标记Art1扩增出的序列在NCBI网站Blast结果显示：扩增的片段物理距离为3582215bp～3582575bp，而通过水稻基因注释网站RAP-DB查询到ART1基因的物理位置处于3580643bp～3582606bp之间，进一步分析发现利用标记Art1的扩增出的片段为ART1基因的部分编码区。实施例3功能标记Art1用于找到耐铝和敏感品种的序列中的应用功能标记Art1用于分子标记辅助选择耐铝水稻品种；利用功能标记Art1可以简单、准确、高效的检测和鉴定耐铝水稻品种；相对于最长根相对伸长量的表型观察，功能标记Art1能够更准确判断水稻品种的耐铝性，能够更有说服力的检测和鉴定耐铝水稻品种。运用软件Bioedit分析序列发现：2份耐铝和3份铝敏感水稻品种相比，如图1所示，在利用标记Art1扩增出的ART1基因的部分编码区有9处差异，其中有7处一个碱基的变异，1处24个碱基的缺失，1处3个碱基的缺失；具体的，a)在第185位点处的碱基为T；b)在第188位点处的碱基为C；c)在第201位点到第224位点处有24个碱基的缺失；d)在第225位点处的碱基为A；e)在第230位点处的碱基为G；f)在第258位点处的碱基为C；g)在第288位点处的碱基为A；h)在第289位点到291位点处有3个碱基的缺失；i)在第326位点处的碱基为C。本发明利用标记Art1对已知的83份丁氏水稻核心种质资源进行了鉴定。根据83份品种的测序结果，发现其中13份与已报道耐铝品种日本晴以及Xiangnuo1序列完全相同，70份与已报道铝敏感品种Xiangzhongxian2、南特号以及IR64序列完全相同。该结果与83份丁氏核心种质资源的最长根相对伸长量的表型观察(选用RRE≥0.5作为判断是否耐铝的标准，傅雪琳等，中国农业科学，2010，43(4):661-669)结果相比较，两者达到了高度的一致性。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。