水稻早抽穗主效QTL分子标记及其鉴定方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别是一种水稻早抽穗主效QTL分子标记及其鉴定方法和应用。
背景技术：
：水稻作为我国乃至世界最重要的粮食作物之一，其产量的提高对于解决未来全球粮食问题具有十分重要的战略意义。然而，现有的水稻品种大都存在着极强的地域和季节局限性，这在很大程度上影响了产量和品质等重要农艺性状的进一步提高，因此改良水稻品种的地域和季节适应性，培育适应特定地区生态环境与栽培耕作制度的水稻新品种，成为当今稻作育种的主要目标之一。抽穗期是决定水稻品种地域和季节适应性的重要农艺性状，对水稻品种的高产和稳产起重要作用，长期以来受到育种家的广泛重视。水稻抽穗期主要由其感光性、感温性和基本营养生长性决定(ChangTT,LiCC,VergaraBS.(1969)Euphytica,18:79-91；TsaiKH.(1985)RiceGenetNewslett,2:77-78；TsaiKH.(1986)In:RiceGenetics.InternationalRiceResearchInstitute,339-349)。由于不同地区的光温条件存在很大差异，因此不同地区早熟水稻品种的改良必须要选择不同类型的早抽穗QTL以适应当地的光温条件。虽然目前水稻中已经克隆到不少与拟南芥开花期基因同源的基因，但它们对花期的调控机理存在着很大的差异；而且，虽然运用同源克隆的方法在水稻中获得的早抽穗基因过量表达后也能使水稻获得早抽穗的特性，但由于遗传背景的差异，导致这些同源基因至今仍无法应用于早熟水稻新品种的培育过程。因此，挖掘水稻早抽穗基因，对培育适应华南双季稻作区生态条件的早熟恢复系品种及其杂交组合、解决育种实践中早熟与丰产难以兼顾的矛盾具有重要意义。在抽穗期基因的定位克隆研究方面，到目前为止，已经有大量抽穗期QTLs定位的报道，但通过图位克隆的方法所挖掘的抽穗期QTL较少，迄今为止，只有Hd1，Hd6，Hd3a，Ehd1，Ehd2，Ghd7，DTH8和EL1(YanoM.etal.(2000)PlantCell,12:2473-2483；Takahashi,Y.etal.(2001)ProcNatlAcadSciUSA,98:7922-7927；KojimaS.etal.(2002)PlantCellPhysiol,43:1096–1105；DoiK.etal.(2004)GenesDev,18:926-936；MatsubaraK.etal.(2008)PlantPhysiol,148(3):1425-1435；XueWY.etal.(2007)NatGenet,40:761-767；WeiXJ.etal.(2010)PlantPhysiol,153:1747-1758；DaiC,XueHW.(2010)EmboJ,29(11):1916-1927)等基因是通过图位克隆的方法克隆的，这些基因的克隆极大地促进了人们对水稻抽穗机理的理解。由于抽穗期QTL的挖掘，可以深化我们对水稻抽穗调控网络的认识和理解，同时，其所获得的分子标记还可以用于辅助选择育种。由于分子标记辅助选择(Marker-AssistedSelection，MAS)方法是对品种的基因型进行的选择，不受环境的影响，因此MAS育种应用于对水稻早抽穗QTL的改良，必将有效的提升育种的效率。技术实现要素：本发明提供了一种水稻早抽穗主效QTL分子标记及其鉴定方法和应用，通过检测与水稻早抽穗主效QTL分子标记，可以确定有无早抽穗基因导入到育种品系中，提高该性状的选择效率、加快育种进度。为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种水稻早抽穗主效QTL分子标记，命名为qHD8.3，所述分子标记分别是RM6670、M55、M07、M13和M15，其对应的引物分别是：RM6670：上游引物：5'—TCCGTCGCTGCAAATTAGTCC—3'；下游引物：5'—CCATGTACCTCTATAATGGCAAGACC—3'；M55：上游引物：5'—CCATTTGGTAGGTCCATCTTACCC—3'；下游引物：5'—CTCCCAAGTGAAGTGCTGTCTGG—3'；M07：上游引物：5'—GGTGGTCTTGATTCCCTTGT—3'；下游引物：5'—GAAACAGATCAGCCTCACTG—3'；M13：上游引物：5'—ATATACAAGCGAACTCCTGT—3'；下游引物：5'—TAAGTGCGATGAAACAATGA—3'；M15：上游引物：5'—TGGCACCATCCTCATTGCTC—3'；下游引物：5'—AGCGTCGTCAGATACATTGG—3'；以上所述的水稻早抽穗主效QTL分子标记的获取方法，包括以下步骤：以DP30为供体亲本，以籼稻品种9311为受体亲本和轮回亲本，通过连续回交、自交并定向选择，在BC4F2代获得稳定遗传的早抽穗染色体片段代换系CSSL13；再将代换系CSSL13与9311杂交，获得F1杂交种，自交后获得F2分离群体，选择F2群体中抽穗期表现为早期或晚期的多个单株，分别种植成F2:3株系，选择F2:3株系没有分离的对应F2单株用于连锁分析，获得权利要求1所述的分子标记。本发明还提供了水稻早抽穗主效QTL分子标记在水稻早抽穗QTL的定位与克隆中的应用。以上所述的水稻早抽穗主效QTL分子标记鉴定方法，包括以下步骤：以待鉴定水稻材料全基因组DNA为模板，利用以上所述的分子标记RM6670、M55、M07、M13和M15对应引物中的一对或多对进行PCR扩增，对扩增产物进行检测：(1)采用分子标记RM6670引物进行扩增，若扩增出177bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在；(2)采用分子标记M55引物进行扩增，若扩增出177bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在；(3)采用分子标记M07引物进行扩增，若扩增出166bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在；(4)采用分子标记M13引物进行扩增，若扩增出43bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在；(5)采用分子标记M15引物进行扩增，若扩增出131bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在。其中，以上所述PCR的反应体系如下：以上所述PCR的反应条件为：94℃变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min。以上所述的分子标记鉴定方法，DNA扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并通过银染显色记录扩增的DNA条带。本发明的目的还在于提供了以上所述的分子标记鉴定方法在选育水稻早抽穗品种中的应用。本发明的有益效果为：(1)本发明发现了一种水稻早抽穗主效QTLqHD8.3分子标记，与先前报道的水稻早抽穗QTL例如Hd1，Hd6，Hd3a，Ehd1，Ehd2，Ghd7和DTH8等不同，丰富了人们对水稻抽穗调控网络的认识和理解，也增加了水稻早抽穗基因资源的多样性，为培育不同类型的早抽穗水稻品种提供了更多的选择；(3)本发明通过水稻早抽穗主效QTLqHD8.3分子标记的发现，可加快该早抽穗QTLqHD8.3的克隆，并可将其应用于辅助选择育种，便于及时的杂交转育，加快育种进程；(2)本发明建立了一种水稻早抽穗主效QTLqHD8.3分子标记鉴定方法，可以准确、快速地鉴别带有qHD8.3的早抽穗单株，提高该性状的选择效率，加快育种进度。附图说明图1是染色体片段代换系CSSL13的抽穗期表型；其中：图1a：正常长日照条件下9311和CSSL13表型上的差异；图1b：2014年早季统计9311和CSSL13各30株的抽穗期，计算平均值，A、B表示0.01水平下差异显著；图1c：2014年晚季统计9311和CSSL13各30株的抽穗期，计算平均值，C、D表示0.01水平下差异显著。图2是F2代单株抽穗期分布图。图3是分子标记引物(M07和M13)对F2代52个晚抽穗单株扩增的部分结果图；其中，图3a：分子标记引物M07对晚抽穗单株的扩增带型；图3b：分子标记引物M13对晚抽穗单株的扩增带型，第10株是交换单株；图4是水稻qHD8.3基因在第8染色体上的初步定位图。具体实施方式下面结合实施实例，对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于以下实施例。实施例1：分子标记的筛选和定位(一)早抽穗染色体片段代换系CSSL13的构建与代换片段分析以9311为受体亲本、广西普通野生稻DP30为供体亲本，通过连续回交、自交并定向选择，在BC4F2代获得的稳定遗传的早抽穗染色体片段代换系CSSL13。根据gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的SSR标记以及水稻籼梗序列差异自行设计的STS标记，对亲本DP30和9311间进行多态性检测，一共检测到408对表现出明显多态性的标记，利用这408对多态性分子标记对CSSL13进行代换片段分析，结果表明，CSSL13共含有5个供体亲本DP30的代换片段，分别位于第1、2、3、8、和11号染色体上，其余背景均来自9311(表1)，这些代换片段的存在可能是造成其抽穗期变异的原因。表1CSSL13的代换片段及其长度编号染色体代换片段长度(kb)SL11RM486-RM11865-RM3151778SL22RM7423-M9-RM13429-RM19206765SL33M11-RM15288-RM4113850SL48RM6670-M55-M07-M13-M155713SL511M230-RM66801792(二)代换系CSSL13的光温反应特性分析在南宁正常短日照(南宁早季)和正常长日照(南宁晚季)的大田条件下，CSSL13分别比受体亲本9311提早抽穗14.2d(图1a、图1b)和13.8d(图1c)，t测验分析表明，CSSL13与9311之间的抽穗期差异皆达到了极显著水平。这表明CSSL13早抽穗的特性可能对光照和温度不敏感。经过光照培养箱严格的长日照与短日照、高温与低温处理(分别以E1和E2处理表示)，如表2所示，结果表明CSSL13和9311之间的抽穗期差异分别为14.5d、14.8d、14.0d和13.0d，差异皆达到了极显著水平(表2)，进一步表明了qHD8.3是一个对光温不敏感的早抽穗QTL。表2代换系材料CSSL13和9311在不同环境条件下的抽穗期天数注：E1：高温长日照环境；E2：遮光处理，10h光照/14h黑暗；E3：白天32℃，夜晚27℃，12h光照/12h黑暗；E4：白天25℃，夜晚20℃，12h光照/12h黑暗。a:表示0.05水平下差异不显著(三)CSSL13/9311的F2分离群体的构建与遗传分析(1)利用早抽穗染色体片段代换系CSSL13与受体亲本9311杂交，获得F1杂交种，种植F1杂交种，自交获得F2分离群体，用于遗传分析。(2)对F2分离群体进行早抽穗鉴定根据田间调查记录结果绘图，结果表明，在F2分离群体的412个单株中，抽穗期为76～100d，如图2所示，呈现明显的双峰分布。以92d为界，把群体分为早抽穗和晚抽穗两大类。早抽穗的单株有297株，晚抽穗的单株有115株。经分析表明，早抽穗和晚抽穗的单株数目符合3:1的分离比例(X2c＝0.94<X20.05,1＝3.841)，这表明CSSL13早抽穗特性受一对显性主效核基因控制。(3)qHD8.3分子标记连锁分析及初步定位从F2分离群体的412个单株中，选取100株早抽穗单株和100株晚抽穗单株，分别单株收种和种植，对这些单株的F2:3株系进行后裔检测，最终筛选出抽穗期稳定遗传的76个早抽穗单株和52个晚抽穗单株用于目标基因的初步定位。利用筛选出来的具有遗传背景的多态性分子标记对这些抽穗期稳定遗传的单株进行连锁分析，结果发现，qHD8.3和8号染色体上的分子标记RM6670和M15存在连锁，两标记处各出现11和5株交换单株，且标记M15上的5株交换单株和标记RM6670上的11株都不相同，表明目标基因可能位于标记RM6670和M15之间；为进一步缩小并明确目标基因的位置，继续利用标记RM6670和M15之间的三对分子标记M55、M07和M13，对稳定遗传的早、晚抽穗单株进行PCR扩增并电泳检测，结果表明，在分子标记M55、M07和M13也分别有6株、2株、1株交换单株，而且分子标记M55上的6株交换单株包含在分子标记RM6670的11株交换单株内，分子标记M07上的2株交换单株包含在分子标记M55的6株交换单株内，分子标记M15上的5株交换单株包含了分子标记M13上的1株交换单株，并且和分子标记RM6670、M55、M07上的交换单株不重复，证实了该基因位于第8染色体上，并且定位于分子标记M07和M13之间，如图3a所示，分子标记引物M07对晚抽穗单株的扩增带型，第20株是交换单株，如图3b所示，分子标记引物M13对晚抽穗单株的扩增带型，第10株是交换单株；结合图4所示，物理距离约为1.6Mb。上述连锁分析和初步定位过程，所采用的DNA提取方法和PCR反应条件分别为：A.用常规的CTAB法提取供体亲本、受体亲本和F2分离群体各单株的DNA；B.PCR的反应体系如下：PCR反应条件为：94℃变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min。DNA扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，通过银染显色记录扩增的DNA条带。由上述过程可以看出利用这些与早抽穗主效QTLqHD8.3的分子标记可以有效地开展早抽穗QTL分子标记辅助选择育种；同时可以利用大的分离群体，加快对早抽穗QTL的精细定位与图位克隆。(四)F2:3株系后代筛选分析利用获得的分子标记M07和M13，在F2:3株系后代中筛选了76个杂合单株构建F3定位群体，杂合单株分单株收获种植，每个株系均出现了抽穗期表型的分离，且早抽穗和晚抽穗单株的分离比符合3:1的比例，其筛选准确率达到100％。说明利用qHD8.3新基因的分子标记M07和M13进行水稻抽穗期的标记辅助选择是有效的。(五)结果分析上述结果表明，利用RM6670、M55、M07、M13和M15可对水稻早抽穗主效QTL进行分子标记，其对应的引物如表3：表3定位的引物及其序列实施例2分子标记鉴定方法以待鉴定水稻材料全基因组DNA为模板，利用以上所述的分子标记RM6670、M55、M07、M13和M15对应引物中的一对或多对进行PCR扩增，对扩增产物进行检测。(一)用常规的CTAB法提取供体亲本、受体亲本和F2分离群体各单株的DNA；(二)PCR的反应体系如下：PCR反应条件为：94℃变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，扩增35个循环，最后72℃终延伸10min。DNA扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，通过银染显色记录扩增的DNA条带。(三)结果分析(1)采用分子标记RM6670引物进行扩增，若扩增出177bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在，若能扩增出168bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段；(2)采用分子标记M55引物进行扩增，若扩增出177bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在，若能扩增出169bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段；(3)采用分子标记M07引物进行扩增，若扩增出166bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在，若能扩增出150bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段；(4)采用分子标记M13引物进行扩增，若扩增出43bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在，若能扩增出52bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段；(5)采用分子标记M15引物进行扩增，若扩增出131bp的扩增片段，则表明有早抽穗主效QTL的存在，若能扩增出117bp的扩增片段，则表明有亲本9311的扩增片段。基于上述5个分子标记来检测水稻品种，可验证是否含有早抽穗主效QTL的存在，可进行早抽穗水稻品种的选育，从而加快育种进度。当前第1页1 2 3