本发明涉及甾体药物的微生物转化技术领域，特别涉及一种发酵降解植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法。
背景技术：
雄烯二酮是合成甾类激素药物重要的原料和中间体，4-雄烯二酮传统的生产工艺是从黄姜等植物中提取薯蓣皂苷，再经化学合成制备4-雄烯二酮；另一种是利用微生物转化植物甾醇生产4-雄烯二酮。前者废水排放量大，黄姜种植不稳定，国家管控越来越严格；后者操作简单、污染较小，为现阶段研究的热点。但是后者也存在一定的缺点，比如一般发酵过程为油水两相发酵，过程投料量低，蒸汽、水、电、人工等消耗大，收率相对于理论值偏低、后提取工艺存在溶剂使用较多等问题。在申请号为201310490547的中国专利申请中公开了雄烯二酮生产配方的优化，在申请号为201410113381的中国专利申请中公开了一种单水相系统发酵降解植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法，在申请号为201310181803的专利申请中公开了一种用于制备雄烯二酮的微生物菌株及其应用，上述方法虽然均对雄烯二酮的制备方法，特别是发酵方法提出了优化设计，但是，上述专利中都存在底物甾醇投料量低的缺点，这样在无形中增加了废水处理的成本，同时发酵罐的利用率低，增加产品成本。虽然使用乳化剂可以代替植物油，但是当底物投料量大于3％时底物剩余量就会大大增加，所以如何提高底物投料量同时提高发酵收率是一个关键性技术难题。
技术实现要素：
基于上述背景技术，本发明提供了一种高底物浓度的4-雄烯二酮的发酵方法，通过添加乳化剂和植物油，使底物植物甾醇的投料量由原来的4％提高到现在的8％，有效的节约了发酵成本，提高了发酵收率，减少了废水的排放。
一种4-雄烯二酮的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)菌种繁殖，所述菌种为mycobacteriumsp.nrrlb-3805；
2)将底物植物甾醇与植物油、乳化剂在发酵罐中混合后升温到100-120℃乳化，并将乳化后的溶液与水、培养基混合后灭菌得到发酵培养基；优选地，在所述植物甾醇、植物油和乳化剂三者中植物甾醇16-20重量份，植物油16-20重量份，乳化剂0.8-1.6重量份；更优选地，在所述植物甾醇、植物油和乳化剂三者中植物甾醇20重量份，植物油16重量份，乳化剂1重量份；
3)将步骤1)繁殖后的菌种接入到步骤2)得到的发酵培养基中进行发酵培养；
4)由经过步骤3)发酵的培养基中提取4-雄烯二酮。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的菌种繁殖是通过包括下述步骤的方法实现的：
a)一级种子罐培养，培养40小时使一级种子罐中的菌种浓度达到5g每100ml发酵液以上；所述一级种子罐的培养基配方为：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸钠4-6g/l，磷酸氢二铵0.4-0.8g/l，以去离子水定容至所需体积并调节ph值至7.5；
b)将步骤a)培养的菌种以10-20％的接种量接种到二级种子罐中，培养30小时，至二级种子罐中的菌种浓度达到10％以上；所述二级种子罐的培养基配方为：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸钠4-6g/l，磷酸氢二铵0.4-0.8g/l，以去离子水定容至所需体积并调节ph值至7.5。
在根据本发明的一个实施方案中，所述菌种浓度的检测方法为取10ml发酵液在离心机上在10000g的条件下离心10分钟，测沉淀湿重，并计算所述沉淀湿重与所述10ml发酵液的比值。
在根据本发明的一个实施方案中，所述步骤2)中发酵培养基包含以下组份：玉米浆干粉20-30g/l，黄豆饼粉15-25g/l，磷酸二氢钾2-4g/l，硫酸镁0.2-0.5g/l，硫酸亚铁0.02-0.05g/l，植物甾醇80-100g/l，乳化剂4-8g/l，植物油80-100g/l，泡敌1-2g/l，ph值7.5-8.0。
在根据本发明的一个实施方案中，所述乳化剂选自吐温60、吐温80、司盘60、曲拉通x-100和卵磷脂中的一种或多种，优选为卵磷脂。
在根据本发明的一个实施方案中，所述植物油选自玉米油、瓜子油、菜籽油、豆油，优选为豆油。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述的发酵培养的发酵条件为：
温度30±1℃，罐压0.04-0.06mpa，搅拌转速100rpm，通气比为0.3-0.5，发酵过程中利用磷酸或者氨水控制ph为7.2±0.2，
当植物甾醇剩余量低于5％时放罐；发酵周期为180±20h。
本发明还提供了一种用于制备4-雄烯二酮的发酵培养基，所述发酵培养基包含以下组份：玉米浆干粉20-30g/l，黄豆饼粉15-25g/l，磷酸二氢钾2-4g/l，硫酸镁0.2-0.5g/l，硫酸亚铁0.02-0.05g/l，植物甾醇80-100g/l，乳化剂4-8g/l，植物油80-100g/l，泡敌1-2g/l，ph值7.5-8.0。
在根据本发明的一个实施方案中，所述乳化剂选自吐温60、吐温80、司盘60、曲拉通x-100、卵磷脂，优选为卵磷脂。
在根据本发明的一个实施方案中，所述植物油选自玉米油、瓜子油、菜籽油、豆油，优选为豆油。
另一方面，本发明具有以下有益效果：
本发明的目的在于提高发酵过程中底物的投料量，推动反应进程，使发 酵的收率得到提高，同时节约人工水电等提高设备利用率，发挥工艺的最佳水平。
由于发酵底物植物甾醇不溶于水，易溶于油，限制了水相中菌体对底物的转化，在申请号为201410113381的中国专利虽然也提到了使用乳化剂实现助溶效果，但是发明人发现仅使用乳化剂无法将大颗粒的底物溶解，阻碍了转化，使其最后的转化率只有73％，发酵培养基中仍然有大量底物剩余，并且发明人也发现单独使用乳化剂时底物的投料量只有1.5％-3％。在付出艰苦的劳动后发明人意外地发现在发酵培养基中使用植物油和乳化剂的混合体系，不仅乳化效果大大提高，而且植物油的使用还可以使底物的投料量达到10％，另外，发明人还发现在转化过程中植物油还可以为菌体的生长提供部分碳源，同时减少了发酵过程中的泡沫。最终根据本发明的技术方案的转化率达到了90％，效价达到了50g/l。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非特别指明，本发明所使用的试剂和材料均可通过商业途径获得。
实施例1种瓶培养
培养基组分为：
将生长成熟的斜面接种到3l大种瓶中，大种瓶的装量为500ml，31.5℃，转速为200rpm，培养时间为40±3h，菌株(mycobacteriumsp.nrrlb-3805)从英国国家工业和海洋细菌保藏中心(ncimb)购买，商品号为ncimb11678。长到对数期后期，菌体量达到最大，ph值达到6.5左右。
实施例2500l一级罐(种子罐)培养：
培养基配方为：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸钠4-6g/l，磷酸氢二铵0.4-0.8g/l，ph值7.5。
将生长好的种瓶接种到500l种子罐，接种量为1l，培养工艺为：温度30±1℃，罐压0.04-0.06mpa，搅拌转速50-100rpm，通气比为0.3-0.5，培养周期为40h。
实施例33吨二级罐培养
培养基配方为：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸钠4-6g/l，磷酸氢二铵0.4-0.8g/l，ph值7.5。
一级罐移种条件：ph值升至7.5以上，显微镜检查没有其他杂菌，菌浓达到5％以上，菌体形态粗壮。
培养工艺为：温度30±1℃，罐压0.04-0.06mpa，搅拌转速50-100rpm，通气比为0.3-0.5，培养周期为30h。
移种条件为：ph小于8.0，菌浓大于10％，镜检正常，菌体粗壮。
实施例4发酵培养：
发酵培养基：玉米浆干粉20-30g/l，黄豆饼粉15-25g/l，磷酸二氢钾2-4g/l，硫酸镁0.2-0.5g/l，硫酸亚铁0.02-0.05g/l，植物甾醇80-100g/l，乳化剂4-8g/l，植物油80-100g/l，泡敌1-2g/l，ph值7.5-8.0。
消毒前先对底物、油、乳化剂进行高温乳化；乳化后加水和培养基进行消毒，消毒温度为125±2℃；
培养工艺为：温度30±1℃，罐压0.04-0.06mpa，搅拌转速100rpm，通气比为0.3-0.5，发酵过程中利用磷酸或者氨水控制ph7.2±0.2。
发酵周期为180±20h，当植物甾醇剩余量低于5％时放罐。
实施例5发酵培养：
发酵培养基：玉米浆干粉25g/l，黄豆饼粉20g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸亚铁0.05g/l，植物甾醇100g/l，乳化剂5g/l，植物油80g/l，泡敌2g/l，ph值8.0。
消毒前先对底物、油、乳化剂进行高温乳化；乳化后加水和培养基进行消毒，消毒温度为125±2℃；
培养工艺为：温度30±1℃，罐压0.04-0.06mpa，搅拌转速100rpm，通气比为0.3-0.5，发酵过程中利用磷酸或者氨水控制ph7.2±0.2。
发酵周期为180±20h，当植物甾醇剩余量低于5％时放罐。
实施例6发酵结果检测(成品提取)
对实施例4的发酵放罐检测转化率大于90％，效价为50g/l；其中，实施例5的发酵放罐检测转化率大于94％，效价为55g/l。
将实例5中得到的发酵液加碱调节ph到9-11，升温到90℃保温皂化，然后加入5％的珍珠岩进行板框过滤，得到滤饼。滤饼用50％-70％甲醇水回流萃取3-5遍，萃取液过滤、脱色、浓缩得到粗品。粗品加入5倍甲醇精制3次得到精品。精品纯度大于99％，单个杂质小于0.5％。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。