一种用于快速检测Ⅰ型糖尿病的融合蛋白的制作方法

本发明涉及一种用于快速检测I型糖尿病的融合蛋白，特别是ICA69和GAD2融合表达的ICA-GAD融合蛋白技术领域。

背景技术：

目前，随着人们生活水平的提高，使人们糖摄入量高，加上运动量少，导致部分人因过度肥胖诱发糖尿病。

糖尿病是一种常见的以高血糖为特征的内分泌代谢疾病，是由于胰岛素分泌缺陷或其生物性能受损而导致的血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，导致各组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经性的慢性损害、功能障碍。糖尿病分为四种类型，即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病。

在I型糖尿病的免疫破坏期间，患者体内会自动产生针对于胰岛细胞自身抗原的抗体。目前已经发现多种胰岛素自身抗体，如：胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛细胞表面抗体(ICSA)、胰岛素抗体(IAA)、热休克蛋白抗体(HSP)、谷氨酸脱羧酶65抗体(GAD65，哺乳动物中GAD的存在形式之一)、蛋白质酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)等。临床上在诊断I型糖尿病常用的指标包括ICA、IAA、GAD、IA-2A等。

目前只能对于I型糖尿病病人中ICA、IAA、GAD、IA-2A等多个自身抗体进行单一测定，步骤繁多且花费较高，效率低，特异性不足，时间长等缺点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对现有现状，提供一种用于快速检测I型糖尿病的ICA-GAD融合蛋白，这种方法可以一次性检测出抗ICA69和GAD2任意一种或两种抗体。这种方法方便、简捷、高效，降低医疗成本和检测时长。

本发明是通过以下技术方案实现的，具体包括以下步骤：

(1)合成目的基因(ICA-GAD)，将目的基因插入蛋白表达载体pet28a中，然后转化到BL21(DE3)宿主菌中，加入IPTG进行目标蛋白的诱导表达；

(2)用Ni柱和透析袋纯化分离出表达蛋白；

(3)对ICA-GAD融合蛋白的活性进行检测。

所述的步骤(1)所述的目标蛋白为ICA69基因和GAD2基因通过融合表达获得的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列：SEQ ID NO：4。

所述的步骤(1)所述目的基因的合成是选自ICA69和GAD2的基因序列直接进行合成的：SEQ ID NO：3 所示。

所述的步骤(1)所述的蛋白表达宿主是BL21(DE3)。

所述的步骤(3)中所述的融合蛋白活性的检测包括抗原的包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应、结果判定。抗原的包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将融和蛋白ICA-GAD稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色剂，于410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

附图说明

图1.载体构建

图1中A部分为PET-28a载体图，其中BamH I和Xho I为酶切位点；B部分为ICA-GAD目标基因图，其中BamH I和Xho I为酶切位点；C部分为插入ICA-GAD目标基因之后的载体图。

具体实施方式

实施例一：基因的融合与表达

(1)目的DNA序列进行人工合成。

(2)目标基因的PCR扩增：为确保得到两者融和表达，利用Primer5.0根据目标基因序列设计特异性扩增引物，引物设计以BamH I和Xho I为酶切位点。引物序列为：

cgggatccat ggcatctccg ggctctggct tttggtct SEQ ID NO：1

ccctcgagtc atgcattgag caattcgtgg ttc SEQ ID NO：2

用高保真DNA扩增系统以合成的DNA序列为模板进行PCR循环获得产物。

(3)扩增后，按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行回收。将目的基因插入载体中：cDNA产物与载体进行连接，转化到PET-28a载体中，根据重组载体的标志(抗Kan或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，进行菌液PCR和双酶切并测序进行阳性验证。将此重组质粒DNA转化到表达宿主菌的感受态细胞BL21(DE3)并涂布于LB培养基平板上。

(4)蛋白表达：挑选含重组质粒的菌体单斑至LB(Kan 100ug/ml)液体培养基中37℃过夜培养。按1∶50比例稀释过夜菌，，37℃振荡培养至OD600值在0.4-1.0(最好0.6，大约3小时)。取部分菌液作为诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3小时。

实施例二：蛋白纯化

诱导的含有目的蛋白的细菌被离心收集，超声破菌，离心收集上清。为了提高目的蛋白的纯化纯度，我们对传统的纯化his融合蛋白的方法进行了相关的改进，在诱导表达后的大肠杆菌上清中加入β-巯基乙醇(使终浓度为5mM)。然后利用含有300mMNacl，20mM Tris-Hcl和40mM的咪唑缓冲液把目的蛋白结合到HIS Trap FF亲和柱子上，然后用含有300mM Nacl，20mMTris-Hcl和500mM的咪唑缓冲液把目的蛋白洗脱下来。在PBS缓冲液中4℃透析过夜，BCA法测定蛋白浓度为1mg/ml。

实施例三：利用Elisa检测来测定免疫活性。

1.包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将融和蛋白ICA-GAD稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色剂，于410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

ELISA 试剂盒检测结果

G.实施效果：本发明提高了I型糖尿病的检出率，在所测的样品中，每个样品只要有抗ICA69和GAD2抗体中的一种或两种存在，显著提高I型糖尿病的诊断效率，可用于制作检测I型糖尿病试剂盒。