一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用。

背景技术：

羧酸酯酶(carboxylesterases，ce)是丝氨酸水解酶家族的重要成员之一，广泛分布于多种哺乳动物细胞内。该酶参与多种酯类药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢，能有效催化羧酸酯类、氨甲酸酯类、酰胺类、硫酯类等外源性物质的水解。在人体中，羧酸酯酶主要包括羧酸酯酶1(ce1)和羧酸酯酶2(ce2)两个亚型，二者具有40％-60％的氨基酸同源性，而在组织分布和底物特异性上存在显著差异。ce2在人肠道和很多肿瘤组织中高表达，在提高很多前药的口服生物利用度中起着十分重要作用，并且其活性也会影响很多酯类抗癌试剂(如伊立替康和卡培他汀)的疗效。机体羧酸酯酶的组织分布与功能差异不仅决定其处置酯类外源物的能力，还与多种癌症的发生发展密切相关。因此，精确测量不同生物体系中ce2的真实活性在临床上意义十分重大。

截至目前，ce2的定量方法有酶联免疫吸附测定法(elisa)、免疫印迹法(westernblotting)、质谱法和荧光检测法等。荧光法由于快速、灵敏精度高等优点而广受欢迎，但是市面上已有的荧光检测方法所使用的底物都存在发射波长短(λem＜650nm)的缺点，受生物基质自身荧光的干扰较大。而近红外荧光探针发射波长处于近红外(λem＞650nm)，可排除背景荧光干扰，灵敏度高，因而开发基于近红外荧光探针的羧酸酯酶2的荧光检测方法具有很大的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速简便的酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒及其使用方法与应用，本发明提供了一种ce2活性检测的试剂盒及其使用方法与应用。该试剂盒使用1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮的苯甲酰酯(ddab)作为ce2的探针底物，经ce2水解后可生成具有良好光学属性的水解产物。基于单位时间产物的生成量来表示酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。

一种检测羧酸酯酶2的试剂盒，该试剂盒包括四种试剂，分别为试剂i、试剂ii、试剂iii和质控标准品；

所述试剂i为：ph＝7.4,100mm磷酸盐缓冲液，

所述试剂ii为0.1～10mm的探针底物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮的苯甲酰酯(ddab)溶液，溶剂为甲醇、乙腈、二甲基亚砜中任意一种，

所述试剂iii为反应终止剂，可选色谱纯乙腈或色谱纯甲醇，

所述质控标准品为5mg/ml的ce2水溶液。

一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒的使用方法，具体按下面步骤进行：

(1)预孵育：在总体积为v0的反应体系中，将待测样品与试剂i混匀，20～60℃下孵育3～5分钟,待测样品终浓度为0-10μg/ml；

(2)起始反应：加入试剂ii混匀，试剂ii的终浓度5μm，20～60℃下孵育5-20分钟；

(3)终止反应：加入体积数为v0的试剂iii，剧烈震荡10秒；

(4)检测：离心后取上清于酶标仪或全自动生化仪检测荧光值，检测条件为：激发波长600nm，发射波长662nm；或测646nm处的吸光值。

(5)回算：取荧光值代入到标准曲线后计算样品中羧酸酯酶2含量。

所述待测样品为：重组表达人源或动物的羧酸酯酶2单酶、含有羧酸酯酶2的细胞或组织制备液、动物活组织切片、含有羧酸酯酶2的各类细胞等生物体系；

一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒的应用，该试剂盒用于羧酸酯酶2活性的快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。

所述试剂盒用于羧酸酯酶2活性的快速定量检测的方法为：探针底物ddab可被羧酸酯酶特异性水解为与发射波长处于近红外的荧光产物ddao；按照试剂盒的使用方法，通过定量检测单位时间内底物的消除量以及水解产物的生成量来测定不同样本中羧酸酯酶2的活性。

该试剂盒用于羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估方法为：以探针底物ddab水解反应作为ce2的特异性探针反应，按照试剂盒的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中ce2的残余活性，进而实现ce2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

该试剂盒检测原理是利用羧酸酯酶2能催化水解酯键的特性，设计一种具有酯键的母体探针分子ddab，ddab可被ce2特异地识别与催化，在生理ph条件下水解生成一种光学属性良好的产物。计算产物在662nm的荧光强度或646nm吸光度变化，得以测定羧酸酯酶2的活力。可以在酶标仪和全自动生化分析仪中检测，其检测原理如下：

本发明所述一种酶法检测羧酸酯酶(ce2)试剂盒的应用领域，包括但不限于下列生物样品中ce2活性的定量测定：1)重组表达人源或动物的羧酸酯酶2单酶；2)含有羧酸酯酶2的细胞或组织制备物；3)动物活组织切片；4)含有ce2的各类细胞系等生物样品。

本发明提供的检测羧酸酯酶2(ce2)的试剂盒的应用，需注意所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间，样品要稀释到标准曲线范围内。

本发明所提供的检测羧酸酯酶2(ce2)的试剂盒，水解产物具有良好的光学属性，可采用荧光/紫外检测器实现产物的快速灵敏检测；此外，该特异性探针底物及相应ce2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种复杂生物体系中ce2酶活的定量测定。

本发明中试剂盒可用于重组羧酸酯酶、细胞或组织制备液等多种生物体系中ce2酶活的定量测定，还可用于快速筛选ce2酶的抑制剂或诱导剂及抑制或诱导能力的定量评价(如图3-图4所示)。

选用本发明所述检测羧酸酯酶2试剂盒及其使用方法具有以下突出优势：

(1)高特异性：1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮的苯甲酰酯类衍生物ddab可被ce2高特异性地代谢成一个代谢产物，即c-7位酯键断裂的水解产物；

(2)廉价易得：底物ddab及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行；

(3)高灵敏度：具有1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮母体结构的化合物均具有良好的光学属性(荧光发射和紫外吸收)，可经荧光法和紫外吸收法通过绘制标准曲线进行定量测定，荧光法检测下限为70ng/ml。

(4)高通量：利用该类荧光探针底物可实现96,386孔板的快速检测，可实现每日2万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉(<0.5元)的优势。

附图说明

图1.加入ce2后光谱变化图(a紫外吸收谱；b荧光发射谱)；

图2.ce2检测标准曲线；

图3.ce2抑制剂筛选图；

图4.ce2诱导剂评估图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括4种试剂：试剂i、试剂ii、试剂iii和质控标准品；

所述试剂i为100mm磷酸盐缓冲液，ph＝7～10；

所述试剂ii为0.1～10mm的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9h)-吖啶酮的苯甲酰酯溶液，溶剂为甲醇、乙腈、二甲基亚砜中任意一种；

所述试剂iii为终止剂，为乙腈或甲醇；

所述质控标准品为5mg/ml的羧酸酯酶2水溶液。

一种酶法检测羧酸酯酶2的试剂盒的使用方法，具体按下面步骤进行：

(1)预孵育：在总体积为v0的反应体系中，将待测样品与试剂i混匀，20～60℃下孵育3～5分钟，待测样品终浓度为0-10μg/ml；

(2)起始反应：加入试剂ii混匀，试剂ii的终浓度5μm，20～60℃下孵育5-20分钟；

(3)终止反应：加入体积为v0的试剂iii，剧烈震荡10秒；

(4)检测：离心后取上清于酶标仪或全自动生化仪检测荧光值，检测条件为：激发波长600nm，发射波长662nm；或测646nm处的吸光值。

(5)回算：取荧光值代入到标准曲线后计算样品中羧酸酯酶2含量。

实施例1

羧酸酯酶2定量时间曲线的绘制

(1)采用5mg/ml的羧酸酯酶2(ce2)的标准溶液，先采用试剂i液稀释成2μg/ml(198μl配10管)，37℃下预孵育5min；

(2)向每个所述溶液样本(198μl)中加入2μl的试剂ii(ddab终浓度为5μm)，37℃震荡孵育，分别于0,2,4,6,8,10,12,14,16,18min向相应的试管里加入等体积试剂iii，剧烈震荡15秒钟终止反应；

(3)检测，荧光法：激发波长600nm，扫描范围630-700nm，间隔2nm；紫外吸收法：测300-700nm的吸收值，间隔2nm。(见图1)。

实施例2

双(对硝基苯基)磷酸酯的抑制实验

(1)取2μl的ce2重组表达单酶(50μg/ml)、人肝微粒体(100μg/ml)、人肠微粒体(100μg/ml)分别加入195μl的试剂i，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

(2)向反应体系中加入1μl羧酸酯酶2的阳性抑制剂双(对硝基苯基)磷酸酯终浓度(0-100μm)，对照组加等体积dmso，继续孵育5分钟；

(3)加入2μl的试剂ii(ddab终浓度为5μm)起始反应；

(3)15分钟后，加入200μl的试剂iii，剧烈震荡后，终止反应；

(4)荧光/紫外检测(λex＝660nm，λem＝662nm；od646nm)；根据各组在662nm下的荧光强度与对照组的比值计算ce2的抑制强度(见图3)，或根据各在646nm处紫外吸收值与对照组的比值表示ce2的抑制强度。

实施例3

ce2诱导剂的定量评估

(1)向hepg2细胞培养体系中加入(0,1，5，80μm)的羧酸酯酶2阳性诱导剂5-fu，培养48h；

(2)收集细胞，机器破碎制成匀浆，4℃，20,000条件下离心20分钟，取上清得细胞s9组分；

(3)用试剂盒的方法分别检测各组细胞s9样本中羧酸酯酶2的活力(图4)，并与对照组比较分析诱导效果。