一种人胎盘中分子量为4．7KD多肽的纯化方法与流程

本发明的一种人胎盘中分子量为4.7KD多肽的纯化方法，属于生物医药技术领域。

背景技术：

目前，人胎盘在我国有悠久的保健历史，是一味重要的人源性药物，在本草纲目中学名叫“紫河车”，在传统医学中还被称为“人胞”或“胞衣”,中医上胎盘药性温补,能滋补强壮、养血填精、益气健脾、改善神经衰弱、提高人体免疫力等；医学研究发现人胎盘中含有大量的多肽、蛋白质、免疫因子、女性激素、助孕酮、类固醇激素、促性腺激素、促肾上腺皮质激素等有效活性成分；经现代医药技术提取的人胎盘提取液，已广泛用于癌症化疗后的辅助治疗、并且能促进乳腺、子宫、阴道、睾丸的发育、对甲状腺也有促进作用、对肺结核、支气管哮喘、以及内分泌失调等亦有良效，还可应用于化妆品中。

我国是最早从事人胎盘多肽研究的国家之一，人胎盘多肽是从人胎盘中所含的多种营养成分中提取出的分子量少于10000 道尔顿的小分子活性功能多肽，目前医学上对人胎盘多肽的研究大多主要集中在功能和应用上，对其中有效成分的纯化研究报道相当少，市场上销售的胎盘多肽提取液和胎盘提取液多为组合成分，这种组合提取液组分相对复杂，可控性差，有效成分利用率和利用效果也难以达到最佳。

技术实现要素：

本发明的一种人胎盘中分子量为4.7KD多肽的纯化方法，主要是为了解决传统工艺中人胎盘提取液组分复杂，可控性差，单一有效成分利用率低，利用效果差等问题，通过样品冻融提取、调pH离心、超滤以及HPLC和RP-HPLC纯化，对人胎盘中4.7KD多肽进行单独纯化，有效的提高了人胎盘中4.7KD多肽的利用率和利用效果，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：一种人胎盘中分子量为4.7KD多肽的纯化方法，该纯化方法按下列步骤依次进行：人胎盘高速匀浆、反复冻融后调pH离心处理、超滤浓缩、HPLC和RP-HPLC纯化。

所述人胎盘高速匀浆、反复冻融后调pH离心处理、超滤浓缩包括如下步骤：

（1）取人胎盘去筋膜后用生理盐水洗去血污，称重后加入胎盘质量2倍的生理盐水匀浆，匀浆温度控制在0℃～4℃之间；

（2）匀浆后样品放入-70℃冰箱冷冻，冷冻后样品再放入室温中融化，样品反复冻融处理3-7次；

（3）冻融后样品用盐酸调pH至3.5～4.5，搅拌均匀后10000rpm离心30min，收集离心上清得人胎盘粗提液；

（4）人胎盘粗提液先用10KD膜包进行超滤，超滤过程中不断向超滤液中补加冷藏后的生理盐水，超滤得到的滤过液再用1KD膜包进行浓缩，超滤温度控制在0℃～4℃之间；

所述HPLC、RP-HPLC纯化包括如下步骤：

（1）用流动相A平衡HPLC柱子，流速0.8ml～1.2ml/min，将（1）步骤中超滤浓缩液过柱，收集流出峰，流动相A为PBS；

（2）用流动相B平衡RP-HPLC柱子，流速0.8ml～1.2ml/min，将收集的HPLC流出峰过柱，收集流出峰，流动相B为含有0.1%TFA的水溶液和含有0.1%TFA的乙腈溶液；

（3）将收集的RP-HPLC流出峰用1KD膜包超滤浓缩，超滤过程中不断加入冷藏后的磷酸盐缓冲液，反复超滤置换体系，得人胎盘4.7KD多肽纯化样品。

所述的人胎盘为怀孕足月的健康人胎盘，胎盘保存良好，无变质无异味。

所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.15mol/L。

所述柱1包括G2000SW，G2000SWXL，G3000SW，G3000SWXL，G4000SW，G4000SWXL，SuperSW2000，SuperSW3000。

所述柱2包括RP-8，RP-18。

由于采用了上述技术方案，本发明通过改进人胎盘传统混合提取工艺，优化提取步骤，可简单、快速、低成本对人胎盘中分子量为4.7KD的多肽进行单独纯化，多肽回收率大于87%，纯度大于92%，纯化后的多肽利用率和利用效果都有明显提高，在现代生物制药行业人胎盘原料严重缺乏的情况下，本发明具有巨大的经济价值和社会效益。

附图说明

图1为为纯化后4.7KD多肽Tricine-SDS-PAGE检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限制。

本发明的实施例：实施例 1：人胎盘粗提液调pH离心及超滤浓缩：取健康足月的人胎盘去筋膜后用生理盐水洗去血污，滤干水分，称取100g加入200ml冷藏生理盐水高速匀浆，匀浆温度控制在0℃～4℃之间，匀浆后样品放入-70℃冰箱冷冻，冷冻凝固后样品再放入室温中融化，样品反复冻融处理4次，冻融后样品用2M/mol盐酸调pH至3.5， 10000rpm离心30min收集上清。离心沉淀加入100ml生理盐水搅拌洗涤30min，洗涤结束后用2M/mol盐酸调pH至3.5，10000rpm离心30min收集上清，合并两次上清液得人胎盘粗提液。

人胎盘粗提超滤液先用10KD膜包进行超滤，超滤温度控制在0℃-4℃之间，超滤至原体积六分之一（约50ml）后向超滤液中不断补加冷藏生理盐酸，每次加入70ml，共加入5次，最后超滤至30-40ml，收集所有滤过液（约600ml），收集的滤过液用1KD膜包进行超滤浓缩，超滤温度控制在0℃-4℃之间，浓缩至50ml左右得人胎盘粗提浓缩液。

HPLC、RP-HPLC纯化及超滤置换：

HPLC安装TSK G2000SWXL凝胶柱，用流动相PBS平衡柱子，流速控制1.2ml/min，柱平衡好后将人胎盘粗提浓缩液进行HPLC，流速控制1.2ml/min，检测波长280nm，收集流出峰进行RP-HPLC。

HPLC安装RP-18柱，用流动相0.1%TFA的水溶液平衡柱子，流速控制1.2ml/min，将收集的HPLC流出峰进行RP-HPLC，流动相调整为0.1%TFA的水溶液100%-0%及0.1%TFA的乙腈溶液0%-100%，时间30min，流速控制1.2ml/min，检测波长280nm，收集流出峰，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测，RP-HPLC纯化后的4.7KD多肽纯度为94%。

将收集的RP-HPLC流出峰用1KD膜包超滤浓缩，超滤过程中不断加入样品等体积的冷藏磷酸盐缓冲液进行体系置换，共加入6次，最后超滤至30-40ml，得人胎盘4.7KD多肽纯化样品。

实施例2：人胎盘粗提液调pH离心及超滤浓缩：取健康足月的人胎盘去筋膜后用生理盐水洗去血污，滤干水分，称取200g加入400ml冷藏生理盐水高速匀浆，匀浆温度控制在0℃～4℃之间，匀浆后样品放入-70℃冰箱冷冻，冷冻凝固后样品再放入室温中融化，样品反复冻融处理3次，冻融后样品用2M/mol盐酸调pH至4.0，10000rpm离心30min收集上清。离心沉淀加入200ml生理盐水搅拌洗涤30min，洗涤结束后用2M/mol盐酸调pH至4.0，10000rpm离心30min收集上清，合并两次上清液得人胎盘粗提液。

人胎盘粗提超滤液先用10KD膜包进行超滤，超滤温度控制在0℃-4℃之间，超滤至原体积十分之一（约60ml）后向超滤液中不断补加冷藏生理盐酸，每次加入100ml，共加入6次，最后超滤至30-40ml，收集所有滤过液（约1100ml），收集的滤过液用1KD膜包进行超滤浓缩，超滤温度控制在0℃-4℃之间，浓缩至60ml左右得人胎盘粗提浓缩液。

HPLC、RP-HPLC纯化及超滤置换：

HPLC安装TSK G2000SWXL 凝胶柱，用流动相PBS平衡柱子，流速控制1.0ml/min，柱平衡好后将人胎盘粗提浓缩液进行HPLC，流速控制1.0ml/min，检测波长280nm，收集流出峰进行RP-HPLC。

HPLC安装RP-18柱，用流动相0.1%TFA的水溶液平衡柱子，流速控制1.0ml/min，将收集的HPLC流出峰进行RP-HPLC，流动相调整为0.1%TFA的水溶液100%-0%及0.1%TFA的乙腈溶液0%-100%，时间30min，流速控制1.0ml/min，检测波长280nm，收集流出峰，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测，RP-HPLC纯化后的4.7KD多肽纯度为93%。

将收集的RP-HPLC流出峰用1KD膜包超滤浓缩，超滤过程中不断加入样品等体积的冷藏磷酸盐缓冲液进行体系置换，共加入6次，最后超滤至30-40ml，得人胎盘4.7KD多肽纯化样品。