一种具有降血糖活性和透皮能力的重组融合蛋白、编码基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种具有透皮吸收作用和降血糖作用的融合蛋白及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术：

糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病，多发于40岁以上的中老年人群。世界卫生组织数据显示全世界目前现有3.47亿糖尿病患者，预测到2030年，糖尿病将成为全球第七大死亡原因。我国是全球糖尿病第一大国，目前有超过9200万的糖尿病患，另外还有1亿5000人将成为患者。无论是糖尿病的传统治疗药物胰岛素，还是新型药物如艾塞那肽都需要每天两到三次注射给药，患者顺应性差。改变肽类降糖药物给药方式，提高患者顺应性，成为目前糖尿病治疗领域的研究热点，具有广阔的市场前景。

透皮给药系统，即经皮治疗系统，是药物通过皮肤吸收的一种给药方法，是近年来国内外药剂学研究的热点。经皮给药是一种理想的给药方式，具有许多显著的优势。有学者利用离子导入、超声技术等方法对胰岛素透皮吸收进行了研究，在一定程度上促进了蛋白质透皮吸收的研究。但是物理方法促渗一般需要较大的配套仪器，而目前用于小分子促渗的化学促渗剂又具有一定细胞毒性，限制这两种方法在上的临床上的使用。细胞穿膜肽具有安全，有效且简单易行等优点，成为了近些年来透皮给药系统的研究热点。

艾塞那肽(Exendin-4)又称促胰岛素分泌肽，是从生长在美国两部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中发现的一种胰高血糖素素样肽(GLP-1)类似物，由39个氨基酸组成，与GLP-1有53％的同源性，属于小分子多肽类激素。其作用方式与GLP-1类似，在进食后可以促进胰岛素分泌及激活胰岛素前体基因转录，具有稳定性好、半衰期长的优点，在糖尿病等治疗方面具有广阔的前景。Exendin-4于2005经美国FDA批准上市，2009年在中国获批上市。丰富的临床使用经验证实Exendin-4能达到与胰岛素治疗相似的血糖控制效果；而且与甘精胰岛素和双时相门冬胰岛素相比，艾塞那肽能更严格地控制餐后血糖，低血糖反应少且有减轻体重的优势。

人类免疫缺陷病毒HIV-I的转录活化因子TAT(HIV trans-activator of transcription)是目前研究最成熟的细胞穿膜肽，1988年美国两个独立的课题研究组同时报道了这种多肽，其独特的细胞穿膜能力引起起了科学界对于TAT功能研究的热潮。至今为止TAT穿膜肽已经被用于多种蛋白、脂质体、纳米颗粒传递、基因治疗、反义寡核苷酸等多个领域的研究。作为细胞穿膜肽的典型代表，TAT穿膜肽提供了一种无毒且高效的通过皮肤屏障的方法，对于大分子药物透皮给药系统具有一定的实际应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有透皮吸收作用和降血糖作用的融合蛋白及其编码基因与应用。

一种融合蛋白，为如下(1)(2)(3)所示：

(1)SEQ ID No.5所示蛋白；

(2)SEQ ID No.5所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的氨基酸序列；

(3)SEQ ID No.5所示蛋白，其特征在于，所示融合蛋白是通过linker将艾塞那肽和TAT穿膜肽连接。

上述蛋白的编码基因也属于本发明保护范围

上述编码基因中，所述编码基因应为如下至少一种：

(1)SEQ ID No.4所示的DNA序列；

(2)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同一性且编码权利1所述蛋白的DNA序列。

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列分子杂交且编码权利要求书1所述蛋白质的DNA序列。

含上述任一所述编码基因的的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌也在保护范围内。

本蛋白除了通过基因工程方法(上述)来获得之外，也可以通过芴甲氧羰基法和叔丁氧羰基法等化学法合成，或通过肽合成仪进行合成。

一种制备上述蛋白的方法也在保护范围内，该方法是将所述的编码基因导入原核细胞进行表达。

在上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述的重组表达载体是将权利要求2或3所述的编码基因插入pET22b(+)的多克隆位点得到的，具体是将权利要求2或3所述的编码基因插入pET22b(+)的Nde I和Hind III位点间得到的。

所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述所述任一方法中，所述表达之后还包括将细胞破碎、离心取上清和、将上清进行分离纯化的步骤。

上述所述方法中，所述的细胞破碎为超声破碎。

所述的上清分离纯化依次进行盐析、除盐、阳离子交换层析、凝胶层析。

上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在降低血糖方面的应用。

上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在改善II型糖尿病患者的血糖控制中的应用。

上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在用于单用二甲双胍、磺酰脲类.以及二甲双胍合用磺酰脲类，血糖仍控制不佳的患者的治疗方面的应用。

上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在超重II型糖尿病患者接受胰岛素治疗前的应用。

附图说明

图1：TAT-艾塞那肽融合蛋白基因琼脂糖凝胶电泳图。

泳道M：DNA marker，泳道1：回收168bpTAT-艾塞那肽融合蛋白基因

图2：TAT-艾塞那肽融合蛋白表达及纯化后SDS-PAGE电泳图

泳道M：蛋白marker，泳道1：TAT-艾塞那肽融合蛋白在大肠杆菌中表达电泳图，泳道2：TAT-艾塞那肽融合蛋白最终纯化结果

图3：不同浓度TAT-艾塞那肽融合蛋白刺激MIN6细胞分泌胰岛素结果：随着TAT-艾塞那肽融合蛋白浓度的提高，MIN6细胞分泌胰岛素的量逐渐增加，且成明显的剂量相关性。证明TAT-艾塞那肽融合蛋白具有和艾塞那肽相同的生物活性，能有效增加MIN6细胞胰岛素分泌量。

图4：TAT-艾塞那肽融合蛋白对大鼠血糖的调节作用结果

实验组，■对照组，▲

与对照组相比，TAT-Exendin-4融合蛋白在皮肤涂抹给药后可以达到一定的降血糖疗效。后续还需对涂抹剂量进行摸索，使得获得更加的治疗效果。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实例中的定量实验，均设置三次重复，结果取平均值。

实施例1重组融合蛋白pET22b-TAT-Exendin-4载体的构建。

委托南京金斯瑞生物科技有限公司通过化学合成法合成含有TAT-Exendin-4的目的基因，并插入到PET22b质粒中。

实例2重组融合蛋白TAT-Exendin-4在大肠杆菌BL21中重组表达。

使用《分子克隆》(卢圣栋编)中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌宿主菌BL21。

在含有AMP的抗性的LB平板上进行转化，经过12-16小时的生长，挑取单克隆转化菌落，在含有AMP抗性的LB液体培养基中过夜培养，进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆，经测序确定含有TAT-Exendin-4的阳性重组质粒中的TAT-Exendin-4融合蛋白序列与理论完全一致。

将上述测序正确的BL21表达重组菌，按照1％的甘油管接种量接入含有终浓度为100μg/ml AMP抗性的LB培养基中，在37℃，220rpm摇床中培养至OD₆₀₀约为1.7时，加入终浓度为0.2μM的IPTG进行TAT-Exendin-4的诱导表达，诱导6h后收集菌体，离心得到湿菌体，并以SDS-PAGE检测。

将上述获得的发酵液在8000rpm离心20min，收集菌体，菌体用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液10ml洗涤两次，8000rpm离心20min收集菌体，将获得菌体用细胞裂解缓冲液100ml搅拌均匀，重悬。于冰箱-20℃中静止过夜，而后在37℃水浴中迅速解冻，反复冻融四次，在冰浴条件下进行超声破壁或冷冻挤压(功率60％、30min、超5s、间隙5s)。待破壁完全后，4℃条件下，12000rpm离心30min，离心后取上清液备用。

实例3重组融合蛋白TAT-Exendin-4的分离纯化。

将实例2获得的蛋白溶液，使用低温冷冻离心机在4℃条件下、12000rpm离心30min，收集上清。在冰浴条件下向上清液中缓慢加入20％硫酸铵粉末，冰箱4℃放置过夜，低温冷冻离心机4℃，12000rpm离心30min。将沉淀用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液复溶，再次4℃，12000rpm离心30min，取上清液。获得的上清液使用Sephadex G-15凝胶柱进行凝胶层析，使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的组分。将获得目的蛋白使用Capto-MMC弱阳离子交换柱进行阳离子交换，先用50mM Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液冲洗，再用含0-2M NaCl的50mM Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液在五个柱体积内进行梯度洗脱并收集含有融合蛋白的组分。将上述收集的融合蛋白组分使用Sephadex G-50凝胶柱进行凝胶层析，使用50Mm Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液进行洗脱，收集含有融合蛋白的组分。使用SDS-PAGE凝胶电泳扫描和反相HPLC对蛋白纯度进行检测。

结果表明经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，只有单一的目的条带，结果如图一所示。经反相HPLC鉴定，蛋白纯度达到90％以上。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，将蛋白储存在-80℃。

实例4重组融合蛋白TAT-Exendin-4促进细胞胰岛素分泌测定实验。

将MIN6细胞培养至长满单层，胰蛋白酶处理约1-2min，待其中90％左右的细胞形态变化后加入3mL细胞培养基，吹打细胞至匀，并转移至离心管中，800rpm离心5min，弃去上清液，在沉淀中加入一定量细胞培养基吹打均匀。处理好的细胞接种于24孔板中，控制细胞数为每孔2×10⁵个左右。当细胞长满单层后换用无血清的培养基培养2h，每孔分别加入终浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、200μg/ml纯化后的TAT-Exendin-4融合蛋白和8mM的葡萄糖溶液，每个浓度设3个复孔，继续培养2h后，用鼠Insulin ELISE测定试剂盒检测MIN6细胞分泌胰岛素的水平。结果表明，重组融合蛋白TAT-Exendin-4刺激INS-1/MIN6后，细胞分泌胰岛素水平呈现明显的量效关系，随着TAT-Exendin-4浓度增加，细胞分泌胰岛素量明显增加，且增加量与融合蛋白用量呈正相关。

实例5重组融合蛋白TAT-Exendin-4对大鼠血糖的调节作用结果

随机选取12只体重200g左右的大鼠，小剂量(50mg/kg)链脲佐菌素连续腹腔注射4天，诱导构建T2D模型小鼠。选择10只构建成功的T2D鼠模型随机分成两组，其中一组为实验组，一组为对照组(n＝5)。通过皮肤处理清除2cm×2cm的毛发，过夜断食后，实验组在裸露部分涂抹50ug溶于生理盐水的纯化后的融合蛋白，对照组在在裸露部分涂抹相等体积的生理盐水，分别在加药0h、2h、4h、6h、8h、10h后进行尾静脉取血，取血后，使用罗氏血糖仪测定大鼠血糖水平，具体操作按罗氏血糖仪标准使用方法进行。结果表明，与对照组相比实验组血糖水平在2h开始下降，在6时达到最低，10小时后，血糖浓度基本恢复到给药前水平。实验结果证明TAT-Exendin-4融合蛋白在皮肤涂抹给药后可以达到一定的降血糖疗效。