一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法与流程

本发明涉及一种微生物检测方法，特别是一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法。

背景技术：

烤烟是我国的重要支柱产业之一，在我国烟草的发展中占有重要地位。由于烟叶在栽培、烘烤和陈化过程中的原因，目前国内烤烟普遍存在淀粉残留量较高等问题。淀粉是烟叶光合作用的主要产物，淀粉是烟叶物质和能量的一种储存形式，在叶绿体中，光合产物除了满足细胞自身代谢活动所需的物质和能量之外，多余的部分基本上转化为淀粉储藏起来，在烟株生命活动所需之时，淀粉又可降解并转化为其它形式的糖类供给各种需求。烟叶上、中、下三个部位的淀粉含量差别较大，烟叶在生长过程中，其淀粉含量逐步增加，随叶片的衰老而显著减少。成熟烟叶的淀粉含量通常在25％左右，烤后烟叶的淀粉含量在2％-8％，淀粉含量超过5％时，则认为对烟叶的品质不利，因为以淀粉形式存在的糖类在烟支燃吸时会影响燃烧速度和燃烧完全性，燃烧时产生糊焦气味，使烟草香味变坏，所以淀粉含量的多少决定着烟叶的内在品质和吸食味的好坏，而淀粉转化形成的糖含量的高低，直接影响烟叶中残留的淀粉量，因此淀粉降解程度是烟叶质量优劣的一个重要指标。

烘烤和陈化过程是烟叶中大分子生物化合物降解转化为有利于香气味水平提高的小分子生物化合物的重要过程。随着中式卷烟对原料质量要求的提高，有必要对烘烤和陈化过程中降解各种大分子生物化合物的酶活性进行研究，以便创造有利环境，促使各种大分子生物化合物的降解。淀粉是烟叶中一种重要的含氮化合物，在烘烤和陈化过程中会发生分解、转化。合理降解烟叶淀粉已成为提高烟叶可用性的关键之一。烟叶中淀粉的降解是在一定温度、湿度和烟叶水分含量条件下，由相关淀粉降解细菌分泌水解酶的水解作用来完成的。在烟叶烘烤和陈化过程中，现有的手段包括利用外加淀粉酶降低烟叶中的淀粉含量，或者利用烟叶表面附着的大量微生物，在烟叶上生长繁殖的过程中分泌释放出多种酶对烟叶陈化过程中发生的水解反应起到促进作用。烟叶表面附着的淀粉降解细菌，除了通过自身的生命活动作用于烟叶的烘烤和陈化过程，还通过其分泌的淀粉酶参与烟叶的生理生化反应，促进烟叶中淀粉的降解，烟叶表面的淀粉降解细菌分泌淀粉酶的作用是其烘烤和陈化过程中的一个重要影响因素，通过淀粉酶及相关化学物质的协同作用，能诱发一系列改善烟叶化学成分协调性和评吸质量的生化反应，促进烟叶中淀粉等生物大分子的生物转化，协调烟叶的内在成分，促进烟叶内部有机物质的分解与转化，调整烟叶中各种化学成分的比例，提高烟叶中香气成分的形成和积累，从而提高烟叶的吸食品质。

淀粉根据结构的差异可分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是由α-1,4-糖苷键连接而成的线性多聚糖，一般占淀粉组成的30％；支链淀粉是由α-1,4-糖苷键和β-1,6-糖苷键连接而成的具有分支的多聚糖，是淀粉的主要组成部分，占70％之多。α-淀粉酶是淀粉水解的起始酶，可随机降解直链淀粉和支链淀粉非末端的α-1,4-糖苷键，作用于直链淀粉的产物是麦芽糖，作用于支链淀粉时，只能水解外围碳链的α-1,4-糖苷键，作用至α-1,6-糖苷键时生成极限糊精。成熟烤烟鲜烟叶含淀粉约40％，烘烤过程中，烟叶淀粉的降解是在一定温度、湿度和烟叶含水量条件下，经α-淀粉酶催化断裂α-1,4-或1,6-糖苷键、产生还原糖等小分子来进行的。

烟叶原材料对烟草生产企业的扩张发展起着重要的作用。由于品种、栽培和调制等原因，我国部分烟叶尤其是低次等烟叶中淀粉含量偏高，影响了烟叶化学成分的协调性，降低了卷烟的吸食品质。合理降解烤后烟叶淀粉含量已成为提高烟叶可用性的关键技术之一，现有的研究表明，烟叶表面附着有众多的微生物，尤以细菌居多，其类型和数量直接关系到烟叶的品质好坏，烟叶表面附着的淀粉降解细菌在其生长过程中合成多种淀粉酶类，正是这些生物酶加快了烟叶中淀粉的降解和转化速度。烤烟烘烤中烟叶淀粉降解程度对烟叶品质有重要的影响，烘烤中烤烟淀粉不降解或降解不完全会严重影响烤后烟叶的色、香、味，卷烟中淀粉含量过高会影响抽吸时的燃烧速度和燃烧完全性，特别是烟叶中残留的淀粉在燃吸时会产生焦糊味、刺激性和杂气，且不耐储存。淀粉降解产生的还原糖含量过低会破坏烟气酸碱平衡、含氮化合物增加，不仅使烟气粗糙、产生焦糊味，而且燃吸时会产生一氧化氮(nitric oxide)、酚类(phenols)和苯类(benzenes)等有害气体。所以，烘烤中烤烟淀粉是否充分降解成为评价烤烟品质的一个重要标准，一般认为，调制好的烟叶淀粉含量应小于3.0％，目前国外优质烟叶淀粉含量为l％-2％，而国产烟叶为4％-6％，烤后烟叶淀粉残留量过高已成为制约国产烟叶质量提高的重要因素之一。

烤烟烘烤中淀粉降解及其进一步转化产物与烤烟香味密切相关，烘烤后，淀粉降解产生的还原糖在抽吸时裂解产生酸性产物，对平衡由烟碱和含氮化合物在抽吸过程中产生的碱性烟气有积极作用，其在很大程度上决定着原烟的香味风格。在烟叶烘烤和陈化过程中，由于淀粉酶的催化作用，烟叶中的淀粉被分解、合成和再转化。烟叶中的淀粉降解为水溶性糖，经过酶处理后的烟叶香气质变好，杂气和刺激性减轻，烟气甜度增大，余味变好，劲头有所降低，烟叶总体质量得到提高。合理降解烤后烟叶中的淀粉含量已成为提高烟叶质量的关键工艺之一。烟叶中淀粉的转化和分解很大一部分依赖于烟叶表面附着的淀粉降解细菌分泌的淀粉酶的作用，淀粉酶的作用从烟叶生长、烘烤，一直到陈化都始终存在。由于淀粉降解细菌分泌的淀粉酶的作用贯穿于烟叶烘烤和陈化过程始终，对烟叶品质的影响较大，因此如何更有效利用淀粉降解细菌分泌的淀粉酶来降解烟叶中的残留淀粉，监控烟叶生长、加工过程中淀粉酶的活性变化规律，已经成为进一步提升烟叶质量成为烟草行业研究的新的挑战。怎样促进烟叶中淀粉的生物转化和控制烟叶中的淀粉的含量对于烤烟的内在品质具有重要的作用。

烟草品种、部位、成熟度对烟叶的淀粉含量及其香气味有着重要的影响。烤烟不同品种、不同部位、不同成熟度档次的烟叶淀粉含量变化规律是烟叶表面附着的淀粉降解菌群活性的关键因素之一。现有的研究表明烟叶中淀粉酶及淀粉含量在烘烤过程各个时期的活性变化规律不同，烘烤过程中烟叶淀粉酶活性分别在烘烤的24h、36h和72h时出现高峰，采用低温低湿变黄，慢速升温定色的烘烤环境，使烟叶内淀粉酶和淀粉磷酸化酶活性较高，有利于烟叶淀粉的降解。烟叶在经过高温烘烤后虽然细胞结构遭受到破坏，但在陈化初期仍然发现有淀粉酶的活性，说明烟叶在烘烤后的陈化过程中烟叶内残留有部分淀粉酶，且淀粉酶有较好的热稳定性。

至今为止，所有研究烟叶表面附着的淀粉降解细菌和淀粉酶的手段都是通过纯培养来进行的，目前促进淀粉降解的方式主要是通过酶制成各种人工酶制剂，利用生长或产酶等竞争优势的淀粉降解细菌菌种添加到烘烤和醇化烟叶中，加快淀粉降解进程，增加烟叶香气和改善烟叶品质。首先从烤烟叶表面上分离筛选得到的具有较高淀粉酶活性的细菌菌株，然后通过发酵后制备成淀粉酶制剂，施用于初烤烟叶上，对烟叶中的淀粉进行降解，使其转化为对烟叶质量有促进作用的单糖和低聚糖，从而改善烟叶的品质与工业可用性。现有的研究表明，对分离自烤烟叶面的产淀粉酶细菌菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens A1)进行发酵培养，提取粗酶液，检测酶活性并应用于初烤烟叶上，结果表明，用菌株A1所产淀粉酶制剂处理后的烟叶总糖增加率为12.78％，还原糖增加率为12.03％，利用从烟叶表面分离的产酶菌株进行发酵生产的酶制剂可促进初烤烟叶中淀粉降解，提高还原糖含量。烟叶表面存在的淀粉降解细菌可以通过自身代谢分泌淀粉酶，促使淀粉含量进一步下降，例如烟草青枯病病菌(Pseudomonas solanacearum)，可产生分解淀粉的酶，如α-淀粉酶。然而采用纯培养方式获得的人工淀粉酶制剂存在以下不足：(1)不管是对烟叶发酵技术条件进行改善还是添加外在酶制剂，由于各地烟叶内在品质不同，不能形成完整统一的烟叶发酵技术；(2)由于酶的活性受到温度、pH、抑制剂等因素的影响，而不同种类的烟叶化学成分不完全相同，发酵条件也不能适合每种酶的作用条件；(3)目前大多采用的是已商品化的商业用酶，由于酶的催化活性受多方面的调节和控制(如温度、酸碱度、酶和底物的浓度以及抑制剂的存在等)，并且烟叶发酵与加工工艺的有其自身的特殊要求，因此简单的商品酶的使用未必完全能够适应所有烟叶发酵中酶处理的需要。

烟叶表面附着的淀粉降解菌群是烟叶烘烤和陈化过程中重要功能菌群之一，由于缺少系统的有关参与烟叶发酵的淀粉降解菌群的原位信息，目前对淀粉降解菌群在烟叶烘烤和陈化过程中的作用的了解主要通过纯培养研究(即通过纯培养分离菌株)，但是，烟叶发酵微生物群落中只有少数(<20％)能够被纯培养，而且通过纯培养研究得到的微生物生理生化信息不一定能反映微生物在复杂的生态系统原位的作用和功能。

技术实现要素：

本发明提供一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法，在原位(in situ)状态下用来探测烟叶表面附着的淀粉降解细菌和监控它们分泌的淀粉酶的活力，即是不需要通过纯培养分离菌株，可应用于针对不同烟叶种类及发酵条件下，监控、调整和促进烟叶淀粉降解细菌的活力，进一步探索出一种可以控制烟叶淀粉酶活力的工艺措施。其原理为：带有荧光的有机大分子BODIPY与淀粉结合，使BODIPY中的荧光被包裹在结合物的内部，在荧光显微镜下观察不到，位于细胞质壁间的α-淀粉酶能水解BODIPY荧光淀粉，释放出带有荧光的短片段水解产物，这些水解产物沉积在有相关酶活力的微生物细胞壁周围，在荧光显微镜下可观察到被荧光标记的单个具有特定α-淀粉酶活性的细胞。

同时，为了排除染色过程中的假阳性，区分具有水解酶活性与没有水解酶活性但能吸收水解产物的细胞(错误标记)，本发明在培养中加入了各种电子传递链抑制剂以保证结果的可靠性。其原理是微生物菌群会水解或发酵加入的标记化合物(BODIPY标记的淀粉)，因此能吸收带有标记的代谢产物的所有细胞也都会被标记，而加入电子传递链抑制剂的可以抑制微生物吸收带有荧光标记的淀粉的水解产物，防止由于主动吸收带有荧光标记物的水解产物而导致的假阳性，保证了所观察到的带有荧光标记的微生物全部都是淀粉降解微生物。

为了得到最优化的培养时间，以保证最大限度的观察α-淀粉酶的活性和标定淀粉降解细菌，本发明搜集了不同烘烤时段的烟叶样品(3h；9h；24h；36h)，分别测试了不同的培养时间，。所观察到的细菌保持同样的现状，只是荧光强度有所区别。经过用软件Image J分析和对比图片，从而得到最优化的培养时间。

为达到上述目的，本发明提供了一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法，包括以下步骤：

(1)样品采集：戴无菌手套并使用一次性的无菌收集袋随机收集烘烤或者陈化过程中的烟叶样品，并保存于18-40度恒温条件下在20min内进行样品处理；

(2)样品处理：用浓度70％酒精消毒剪刀，在无菌条件下，将烟叶样品用消毒过的剪刀剪成若干小块，并仔细除去烟叶的茎和叶脉等无用组织；

(3)稀释样品：无菌条件下，称取新鲜的碎叶样品，加入到pH4.0-9.0为灭菌1×PBS缓冲液，缓冲液其用量为碎叶样品质量的10-30倍，与碎叶样品混合均匀；

(4)细胞分离：将步骤(3)得到的混匀液体分三次分别倒入搅拌机搅拌打碎，每次1-5分钟，然后将三次打碎后的液体混合后倒入搅拌机高速档匀浆，过滤，将滤液离心并去除上清液，将去除上清液的沉淀物重新悬浮于装有pH4.0-9.0为灭菌1×PBS缓冲液的离心管中，得到细胞悬浮液；

(5)超声波处理：将离心管放入超声波仪器中固定，在确保超声波处理时离心管不会移动的前提下，用10000-80000Hz的频率处理50-140分钟后取出待用；在等待下一步的处理过程中，将装有细胞悬浮液的离心管储存于4℃的冰箱中；

(6)淀粉降解微生物的标定和示踪：经离心处理并去除上清液的细胞悬浮液中，依次加入6-15mmol/L,pH 5.1-9.0灭菌的1×Tris-HCl缓冲液和灭菌的氟化硼二吡咯类荧光染料BODIPY标记的绿色荧光淀粉染液，形成混合液体，并立即将混合液体转入到无菌的宽底血清瓶中，加入灭菌的电子传递链抑制剂，将盖子盖好，用铝箔包严避光；室温摇动30-120min，速度保持在100-500rpm进行培养；无菌环境下吸取10-50μL培养得到的反应液均匀涂布于明胶涂层载玻片上，并在无菌环境中避光风干；所述电子传递链抑制剂为1-10mmol/L叠氮化钠、1-10mmol/L氟乙酸钠和1-10mmol/L碘代乙酰胺钠组成的混合溶液；

(7)显微镜观察：将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上，100×的物镜下进行观察和拍照，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光即为淀粉降解细菌。

优选地，步骤(7)所述的明胶涂层载玻片按如下步骤处理：

(1)取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中；在3.5L蒸馏水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸10min；取出载玻片架，晾3min；用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干；

(2)在3.5L蒸馏水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至60-80℃，待明胶基本溶解后放入载玻片架，恒温10min；取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上干燥即得。

优选地，步骤(4)所述将混匀的液体分三次分别倒入家用搅拌机搅拌打碎，每次3分钟，然后将三次打碎后的混合液体转入到无菌BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器3档匀浆3min，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，将滤液收集在无菌的50ml离心管中，5000g离心8min去除上清液，并将沉淀物放入2ml离心管中，重新悬浮于装有pH4.0-9.0的灭菌1×PBS缓冲液中。

优选地，步骤(4)所述的离心处理具体是4500g-5000g离心5-10min。

优选地，步骤(6)所述的离心处理具体是4500g-5000g离心8-12min。

优选地，步骤(6)所述的1×Tris-HCl缓冲液的体积与所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光染液的体积与1×Tris-HCl缓冲液体积相同；电子传递链抑制剂的体积与1×Tris-HCl缓冲液体积相同。

本发明从烟叶烘烤和陈化过程中复杂的混合微生物群落中示踪和标定烟叶淀粉降解菌群，采用分子微生物生态学方法和手段即BODIPY淀粉酶(amylase)染色来标定和追踪原位状态下烟叶淀粉降解菌。和以前的纯培养方法相比，本发明方法可以直接标定和监控烟叶淀粉降解菌群对烟叶品质以及对烟叶降解的生化过程的程度和速率的影响，较大地降低了劳动强度，成本较低，操作过程简便，操作人员不需要特殊的培训，对采样地点无特殊的要求，实验结果准确无误，能迅速提供给诊断人员相关的数据。

采用免培养的分子微生物生态学方法和手段即BODIPYα-淀粉酶(α-amylase)染色来标定和追踪原位状态下烟叶表面附着的淀粉降解菌群以及它们的活性，不仅对于探测烟叶淀粉降解菌群的活性变化规律具有重要的意义，还能进一步了解烟叶淀粉降解菌群在烟叶烘烤和陈化过程中的作用和功能，获取原位状态下烟叶淀粉降解菌群的组成和结构的原位信息，了解淀粉降解菌群对不同品种、不同部位、不同成熟度档次的烟叶淀粉含量变化规律的响应。通过将该方法应用在烟草发酵或加工过程中，可以控制和促进烟叶淀粉降解菌群的活性，弥补烟叶因生长或调制不当造成的不足，从而达到改善烟叶吸味品质的目的，同时也能大大缩短发酵过程，节约成本，大幅度提升经济效益。

本发明的所述方法可以应用于烤烟不同品种、不同部位、不同成熟度档次的烟叶，获得在原位状态下烟叶淀粉降解菌群的信息，还能迅速提供给技术人员相关的数据，弄清具体的烟叶发酵增香机理，可以更好地指导实践、探索和完善烟叶处理的工艺措施和条件、拓宽创新烟叶发酵技术研究思路、积极开展与之相关的新领域研究。

附图说明

附图1为检测烟叶中淀粉降解微生物的方法流程图；

附图2为烟叶表面微生物群落中绿色荧光淀粉染色阳性淀粉降解微生物显微照片示例，图中A处指明的是在BODIPY DQ starch染色后烟叶表面附着的淀粉降解细菌，B处指明的是在烟叶被打碎后的植物组织。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、分析化学技术及相关领域的常规技术。

实施例一：一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法，步骤如下：

样品收集：戴无菌手套、使用一次性的无菌收集袋随机收集1kg烘烤或者陈化过程中的烟叶样品，并保存于37℃恒温条件下在20min内送实验室进行样品处理；

样品处理：在实验室首先用浓度70％酒精消毒剪刀，无菌条件下，将烟叶样品用消毒过的剪刀剪成1-4cm²小块，并仔细除去烟叶的茎和叶脉等无用组织；

稀释样品：无菌条件下，用无菌的50ml烧杯称取30g新鲜的碎叶样品，加入300ml样品处理试剂A，与碎叶样品混合均匀；

细胞分离：将混匀的液体分三次分别倒入飞利浦(PHILIPS)家用搅拌机搅拌打碎，每次3分钟，然后将三次打碎后的混合液体转入到无菌BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器3档匀浆3min，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，将滤液收集在无菌的50ml离心管中，5000g离心8min；去除上清液，并将沉淀物放入2ml离心管中，重新悬浮于2ml样品处理试剂A中；

超声波处理：将装有混合液体的离心管固定，然后放入超声波仪器中，在确保在超声波处理时离心管不会移动的前提下，用53000Hz的频率处理60分钟后取出待用。在等待下一步的实验过程中，可将细胞悬浮液储存于4℃的冰箱中；

淀粉降解微生物的标定和示踪：取400μL细胞悬浮液(从上一步中获得)转入到无菌的2mL eppendof离心管中，离心(4500g)10分钟，去除上清液，加入400μL标定示踪试剂B1、200μL标定示踪试剂B2，并立即将混合液体转入到无菌的10ml宽底血清瓶中，再加入电子传递链抑制剂C，将盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；室温摇动45min，速度保持在220rpm；无菌环境下吸取10μL反应液均匀涂布于明胶涂层载玻片上，并在无菌环境中避光风干；

显微镜观察：将干燥好的载玻片置于荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)物镜台上，100×的物镜下进行观察和拍照通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光。

其中，所述明胶涂片按以下步骤进行处理：

取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中；在3.5L蒸馏水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸10min；取出载玻片架，晾3min；用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干；

在3.5L蒸馏水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至70℃左右，待明胶基本溶解后放入载玻片架，恒温10min；取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上干燥即得。

其中，所述样品处理试剂A为灭菌1×PBS缓冲液，pH＝6.0。

其中，所述标定示踪试剂B1、B2分别为灭菌Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH 7.8)和灭菌BODIPY(氟化硼二吡咯类荧光染料，boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光淀粉染液。

其中，所述电子传递链抑制剂C为总量为0.6ml的灭菌3mmol/L叠氮化钠、2mmol/L氟乙酸钠、4mmol/L碘代乙酰胺钠混合溶液。

实施例二：一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法，步骤如下：

样品收集：戴无菌手套、使用一次性的无菌收集袋随机收集1kg烘烤或者陈化过程中的烟叶样品，并保存于30℃恒温条件下在20min内送实验室进行样品处理；

样品处理：在实验室首先用浓度70％酒精消毒剪刀，无菌条件下，将烟叶样品用消毒过的剪刀剪成1-4cm²小块，并仔细除去烟叶的茎和叶脉等无用组织；

稀释样品：无菌条件下，用无菌的50ml烧杯称取30g新鲜的碎叶样品，加入600ml样品处理试剂A，与碎叶样品混合均匀；

细胞分离：将混匀的液体分三次分别倒入飞利浦(PHILIPS)家用搅拌机搅拌打碎，每次4分钟，然后将三次打碎后的混合液体转入到无菌BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器3档匀浆3min，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，将滤液收集在无菌的50ml离心管中，4500g离心10min；去除上清液，并将沉淀物放入2ml离心管中，重新悬浮于2ml样品处理试剂A中；

超声波处理：将装有混合液体的离心管固定，然后放入超声波仪器中，在确保在超声波处理时离心管不会移动的前提下，用73000Hz的频率处理50分钟后取出待用。在等待下一步的实验过程中，可将细胞悬浮液储存于4℃的冰箱中；

淀粉降解微生物的标定和示踪：取400μL细胞悬浮液(从上一步中获得)转入到无菌的2mL eppendof离心管中，离心(5000g)8分钟，去除上清液，加入400μL标定示踪试剂B1、200μL标定示踪试剂B2，并立即将混合液体转入到无菌的10ml宽底血清瓶中，再加入电子传递链抑制剂C，将盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；室温摇动60min，速度保持在280rpm；无菌环境下吸取10μL反应液均匀涂布于明胶涂层载玻片上，并在无菌环境中避光风干；

显微镜观察：将干燥好的载玻片置于荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)物镜台上，100×的物镜下进行观察和拍照通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光。

其中，所述明胶涂片按以下步骤进行处理：

取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中；在3.5L蒸馏水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸10min；取出载玻片架，晾3min；用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干；

在3.5L蒸馏水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至60℃左右，待明胶基本溶解后放入载玻片架，恒温10min；取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上干燥即得。

其中，所述样品处理试剂A为灭菌1×PBS缓冲液，pH＝9.0。

其中，所述标定示踪试剂B1、B2分别为灭菌Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH 7.8)和灭菌BODIPY(氟化硼二吡咯类荧光染料，boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光淀粉染液。

其中，所述电子传递链抑制剂C为总量为0.6ml的灭菌3mmol/L叠氮化钠、2mmol/L氟乙酸钠、4mmol/L碘代乙酰胺钠混合溶液。

实施例三：一种检测烟叶中淀粉降解微生物的方法，步骤如下：

样品收集：戴无菌手套、使用一次性的无菌收集袋随机收集1kg烘烤或者陈化过程中的烟叶样品，并保存于25℃恒温条件下在20min内送实验室进行样品处理；

样品处理：在实验室首先用浓度70％酒精消毒剪刀，无菌条件下，将烟叶样品用消毒过的剪刀剪成1-4cm²小块，并仔细除去烟叶的茎和叶脉等无用组织；

稀释样品：无菌条件下，用无菌的50ml烧杯称取50g新鲜的碎叶样品，加入1000ml样品处理试剂A，与碎叶样品混合均匀；

细胞分离：将混匀的液体分三次分别倒入飞利浦(PHILIPS)家用搅拌机搅拌打碎，每次5分钟，然后将三次打碎后的混合液体转入到无菌BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器3档匀浆5min，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，将滤液收集在无菌的50ml离心管中，5000g离心10min；去除上清液，并将沉淀物放入2ml离心管中，重新悬浮于2ml样品处理试剂A中；

超声波处理：将装有混合液体的离心管固定，然后放入超声波仪器中，在确保在超声波处理时离心管不会移动的前提下，用80000Hz的频率处理120分钟后取出待用。在等待下一步的实验过程中，可将细胞悬浮液储存于4℃的冰箱中；

淀粉降解微生物的标定和示踪：取400μL细胞悬浮液(从上一步中获得)转入到无菌的2mL eppendof离心管中，离心(5000g)12分钟，去除上清液，加入400μL标定示踪试剂B1、200μL标定示踪试剂B2，并立即将混合液体转入到无菌的10ml宽底血清瓶中，再加入电子传递链抑制剂C，将盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；室温摇动90min，速度保持在300rpm；无菌环境下吸取10μL反应液均匀涂布于明胶涂层载玻片上，并在无菌环境中避光风干；

显微镜观察：将干燥好的载玻片置于荧光显微镜(莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机)物镜台上，100×的物镜下进行观察和拍照通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光。

其中，所述明胶涂片按以下步骤进行处理：

取7个载玻片架，将载玻片填满于载玻片架中；在3.5L蒸馏水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸10min；取出载玻片架，晾3min；用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将载玻片保持直立状态晾干；

在3.5L蒸馏水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至80℃左右，待明胶基本溶解后放入载玻片架，恒温10min；取出载玻片架，将载玻片斜立于试管架边上干燥即得。

其中，所述样品处理试剂A为灭菌1×PBS缓冲液，pH＝5.0。

其中，所述标定示踪试剂B1、B2分别为灭菌Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH 7.8)和灭菌BODIPY(氟化硼二吡咯类荧光染料，boron-dipyrromethene)标记的绿色荧光淀粉染液。

其中，所述电子传递链抑制剂C为总量为0.6ml的灭菌3mmol/L叠氮化钠、2mmol/L氟乙酸钠、4mmol/L碘代乙酰胺钠混合溶液。

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。