本发明属于药物
技术领域：
，具体涉及从灯心草的干燥茎髓中分离得到的一种具有治疗涎腺腺样囊性癌作用的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法。
背景技术：
：灯心草别名灯芯草、灯草，为灯心草科植物灯心草JuncuseffususL.的干燥茎髓。夏末至秋季割取茎，晒干，取出茎髓，理直，扎成小把。为多年生稀一年生草本，主产于江苏、福建、四川、贵州、云南，通常生长在草甸、沼泽、水边及阴湿的环境中。味甘、淡，性微寒，归心、肺、小肠经，是治疗心烦少眠、高热口渴、尿少涩痛、小儿疳积、口舌生疮等症的传统药物。各国学者对灯心草属植物的化学成分进行了一系列研究，发现其化学成分比较复杂，主要含二萜类、三萜类、苯并香豆素类、甾类化合物，此外还含有黄酮类、糖类及苷类等。灯心草属植物在中国和日本都有悠久的药用历史，被收录于很多医药学著作。灯心草属植物中大部分化合物为具有二氢菲和菲母核的二萜类化合物，并且都具有酚羟基，因此许多化合物都具有较好的生物活性。灯心草具有抗藻活性、抗菌活性、抗湿疹活性、抗氧化活性、抗病毒活性、镇静作用等。技术实现要素：本发明的目的是提供一种从灯心草的干燥茎髓中分离得到的一种具有治疗涎腺腺样囊性癌作用的半日花烷型二萜类化合物及其制备方法。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将灯心草的干燥茎髓粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1、45:1、20:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80％。一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗涎腺腺样囊性癌的药物中的应用。所述的药物组合物在制备治疗涎腺腺样囊性癌的药物中的应用。本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。附图说明图1为化合物(Ⅰ)结构式；图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。制备方法：(a)将灯心草的干燥茎髓(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(157g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为75:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、20:1(8个柱体积)、12:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(49g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(25g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集10-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(235mg)。结构确证：白色粉末，熔点136～138℃；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z389.2702，结合核磁特征可得分子式为C22H38O4，不饱和度为4。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，500MHz)：H-1(0.86，m)，H-1(1.58，dt，J＝13.5，5.0)，H-2(1.29，m)，H-2(1.44，m)，H-3(1.01，m)，H-3(1.25，m)，H-5(0.84，d，J＝11.6)，H-6(1.11，m)，H-6(1.49，m)，H-7(1.27，m)，H-7(1.68，dt，J＝12.8，4.3)，H-9(0.97，m)，H-11(1.22，m)，H-11(1.40，m)，H-12(1.29，m)，H-12(1.46，m)，H-14(5.54，s)，H-15(7.28，s)，H-16(1.07，s)，H-17(1.08，s)，H-18(0.79，s)，H-19(0.71，s)，H-20(0.72，s)，15-OAc(2.01，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，125MHz)：39.2(CH2，1-C)，18.1(CH2，2-C)，41.4(CH2，3-C)，32.8(C，4-C)，55.5(CH，5-C)，20.0(CH2，6-C)，43.6(CH2，7-C)，75.1(C，8-C)，61.5(CH，9-C)，38.7(C，10-C)，17.9(CH2，11-C)，38.8(CH2，12-C)，71.1(C，13-C)，114.2(CH，14-C)，135.4(CH，15-C)，28.7(CH3，16-C)，24.1(CH3，17-C)，32.8(CH3，18-C)，21.2(CH3，19-C)，15.1(CH3，20-C)，171.1(C，15-OAC)，20.3(CH3，15-OAC)；碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有羟基和酯基(3423cm-1和1740cm-1)。1H-NMR谱显示了五个甲基信号δH0.71(s，H3-19)，0.72(s，H3-20)，0.79(s，H3-18)，1.07(s，H3-16)和1.08(s，H3-17)，一个乙酰氧基δH2.01(3H，s)，两个烯属次甲基信号δH5.54(s，H-14)和7.28(s，H-15)。此外，13C-NMR谱显示出22个碳信号，包括六个甲基，七个亚甲基，四个次甲基(两个烯属次甲基)，以及五个季碳(一个羰基碳，两个含氧碳)。HMBC谱中H-14(δH5.54)，Me-16(δH1.07)和H2-12(δH1.29和1.46)与C-13(δC71.1)的相关性表明C-13位连有一个羟基。此外，H-15(δH7.28)，Me-16和H2-12与C-14(δC114.2)的相关性以及C-15的化学位移(δC135.4)表明C-14和C-15之间为双键。HMBC谱中H-15(δH7.28)和甲基质子信号(δH2.01)与羰基碳(δC171.1)的相关性表明乙酰氧基位于C-15位。NOESY谱中，Me-20(δH0.72)，Me-17(δH1.08)和H-11β(δH1.22)；H-11β，Me-16(δH1.07)与Me-17；以及Me-17和H-7β(δH1.68)的相关性表明Me-17，Me-20和Me-16为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验一、材料和仪器腺样囊性癌细胞系SACC-M购自上海交通大学医学院口腔颌面外科实验室。化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％。RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购于美国SIGMA公司。标准胎牛血清购自邢台市汇丰生物技术研究所。Annexin-v-FITC/PI试剂盒购于北京宝赛生物技术有限公司。PBS购于天津市光复精细化工研究所。MTT粉购于Amresco公司。二乙胺四乙酸二钠(EDTA)购于北京益利精细化学品有限公司。青霉素、链霉素购于华北制药有限公司。二甲基亚砜(DMSO)购于天津标准科技有限公司。Giemsa染液购于珠海贝索技术有限公司。XYJ型医疗净化工作台(苏州净化设备有限公司)，BB5060/BB16二氧化碳培养箱(上海Heraeus公司)，CX21光学显微镜(日本OLYMPUS)，XD-10198101倒置显微镜(江南公司)，流式细胞仪(BectionDickinsonFacscaLibur)，WeLLscanMK3全自动酶标仪(芬兰LabsystemsDragon)，BFX5-320型低速离心机(中国上海泸南科学仪器联营厂)，GF-300型电子天平(JapanA&DCompany，Limited)，725型超低温冰箱(FormaScientific.Inc)，微量加样器(EPPENDORF公司)。二、试验方法1、细胞培养1.1细胞复苏预备37℃恒温水浴箱，将液氮保存的SACC-M细胞冻存管取出，直接投入水浴箱，轻轻摇动，待其迅速融化后，从水箱中取出冻存管，此步骤宜快，应在30-60秒内完成。之后以75％酒精擦拭消毒管口后开启冻存管，将管内细胞悬液吸出，滴入50mL离心管并在离心管中滴加10倍以上含10％血清的RPMI-1640培养液，轻轻吹打，使其成为细胞悬液，低速离心(1000转/分)5分钟后，吸去上清液，再用10％的RPMI-1640培养液洗涤一次，并再次离心，吸去上清液后，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞稀释成细胞悬液，接种于50mL培养瓶中，轻轻拧松瓶盖，然后放入CO2培养箱中培养，第二日更换一次培养液，之后在培养液颜色由淡红变黄后更换培养液，观察细胞爬满瓶底壁的80％时，进行细胞传代。1.2细胞传代首先使用弯头吸管吸取原培养液后，反复吹打瓶底，之后去除瓶内旧培养液，向瓶内加入混合消化液(0.25％胰蛋白酶和0.04％EDTA1:1)少量(以能够完全覆盖培养瓶底为宜)，缓慢摇动瓶身使消化液浸湿瓶底，然后吸去大部分消化液，仅留少量进行消化。将培养瓶置于CO2培养箱内(或25℃室温下)进行消化，2～5分钟后取出培养瓶，放倒置显微镜下观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大，部分细胞由多角形变为圆形，且已有细胞开始悬浮时，应立即停止消化。吸出残存的消化液，加入适量不含血清的培养液，轻轻转动培养瓶，冲掉残留的消化液后，将其吸出，再加入新培养液，用弯头吸管吸取瓶内培养液后反复吹打瓶底，使贴。于瓶底的细胞脱离，形成细胞悬液，注意吹打时动作要轻柔，以防用力过猛，使细胞受损。吸取细胞悬液置于离心管内，离心后，去上清，收集细胞，加入适量含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，将细胞吹打成混悬液，计数，以1.0×105/mL浓度接种在新的培养瓶内。2、MTT比色试验(1)接种细胞：取对数生长期细胞，用含有10％胎牛血清的1640培养液制成浓度为2×105/mL的单细胞悬液，接种于96孔板内，每孔100μL。(2)培养细胞：将上述96孔板置于CO2培养箱，在37℃、5％CO2以及饱和湿度条件下，继续培养24h。(3)加药：用药组每孔加入稀释后的化合物(Ⅰ)药液100μL，使其终浓度为2.5、5.0、7.5、10、12.5mmol/L；对照组每孔加100μL不含血清的1640培养液。用药组和对照组每组均设6个复孔，并设调零孔，加药后继续培养。(4)呈色：继续培养24h、48h和72h后，用药组和对照组每孔加入浓度为5g/L的MTT溶液20μL，继续培养4h后，吸去全部上清液，在各孔中加入200μL的二甲基亚砜(包括调零孔)，置振荡器上振荡摇匀1分钟，使结晶充分溶解。(5)比色：将96孔板置于酶标仪上，在波长为490nm处，测定各孔吸光度值(A)。重复实验3次，取其平均值。(6)计算并绘图：细胞增殖抑制率＝(1-用药组平均A值/对照组平均A值)×100％。根据以上公式计算各浓度的生长抑制率，然后以时间为横轴，抑制率为纵轴，绘制5个浓度的抑制率曲线。3、流式细胞术检测3.1细胞的处理细胞接种、培养后，取对数生长期细胞，以2×105/mL浓度接种于6孔板中，而后加药，设时间对比组、浓度对比组和对照组(正常凋亡组)：(1)时间对比组：将细胞接种于6孔板中，培养24小时，细胞贴壁后，用吸管沿各孔壁将原培养液彻底吸出，然后于各孔加入等量的终浓度为12.5mmol/L含化合物(Ⅰ)药液的培养液(用药组)。加入不含化合物(Ⅰ)的培养液作为对照组，分别继续培养24h、48h、72h。(2)浓度对比组：细胞接种并贴壁成功后，用吸管彻底吸净原培养液，各孔中分别加入终浓度为2.5、5.0、7.5、10、12.5mmol/L的含化合物(Ⅰ)培养液(用药组)。对照组加入不含化合物(Ⅰ)的培养液，继续培养72h。(3)正常凋亡组：接种细胞并贴壁成功后，去除各孔中原培养液，加入不含化合物(Ⅰ)的培养液，继续培养24h、48h、72h。3.2样品的制备(1)收集细胞：分别吸取6孔板各孔上清液，加入离心管中，取PBS液2mL漂洗6孔板各底壁后，倒入同一离心管内，然后将2mL混合消化液滴入各孔中消化细胞，缓慢摇动培养板使消化液完全浸湿其底壁，消化2min后将消化液吸入各离心管，再加入2mL培养液吹打各孔底壁，细胞彻底脱壁后，吸入离心管中。(2)离心细胞：将离心管置于低速离心机中，于1500rpm离心5min后，弃去上清液；加入12mLPBS液重悬细胞，再于1500rpm离心5min，弃上清液；再滴入3mL的PBS液于离心管中重悬细胞后，将细胞悬液吸至流式细胞仪专用上机管中，1500rpm离心5min后，弃上清液。3.3Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞法检测细胞凋亡(1)用微量加样器向流式管中加入10μL的Annexin-V-FITC和5μL的PI(两种试剂勿相混，勿和管底细胞相接触)。(2)加入200μL结合缓冲液，将Annexin-V-FITC和PI冲至管底与细胞相混，并轻轻吹打，形成单细胞悬液。(3)避光反应15min或放入4℃冰箱30min。(4)上机前加入300μLPBS结合缓冲液，并轻轻吹打，而后立刻上机(流式细胞仪)检测。光源为488nm氩离子激光器，每份标本收集细胞10000个，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光。(5)经流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的散点图，图上每一个点代表一个细胞，都具有两个参数值。左上Q1象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)，右上Q2象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(An+PI+)，左下Q3象限代表正常细胞(An-PI-)，右下Q4象限代表早期凋亡细胞(An+PI-)。4、统计学分析使用统计学软件SPSS10.0进行统计分析。(1)使用析因设计的方差分析，对相同药物浓度不同处理时间、相同处理时间不同药物浓度各组之间化合物(Ⅰ)对SACC-M细胞的生长抑制率进行两两比较。(2)使用简单相关分析，分析生长抑制率与作用时间之间、抑制率与药物浓度之间的相关性，得出相关系数r，并对r值进行t检验，从而得出药效随时间和浓度的变化关系。(3)使用二项分布的u检验对流式细胞术检测的各用药组及对照组的凋亡率进行统计分析。三、结果及结论1、MTT比色试验(1)实验表明化合物(Ⅰ)对SACC-M细胞有明显增殖抑制作用，作用24、48、72h后最高抑制率可达80.4％(表1)。(2)相同处理时间、不同浓度组之间的抑制率比较有明显差异(P<0.01)；相同浓度组、不同处理时间之间的抑制率有明显差异(P<0.01)；药物浓度和处理时间无交互作用(P＝0.901)。(3)组间两两比较：相同时间、不同浓度组之间，抑制率有明显差异(P<0.01)；处理24h、48h、72h后，同一浓度、不同时间组之间有明显差异(P<0.01)。(3)药效(抑制率)与作用时间和药物浓度均具有正相关性，抑制率与作用时间具有正相关性(r＝0.291，P＝0.042)；抑制率与浓度具有正相关性(r＝0.926，P<0.001)。2、流式细胞术检测2.1对照组细胞的凋亡情况对照组(正常凋亡组)细胞均属于自然凋亡，24h时其凋亡率为4.9％，48h时的凋亡率为7.1％，72h的凋亡率为6.1％(表2)，凋亡率随培养时间差别不大，无统计学意义。2.2用药组细胞随时间变化凋亡情况经12.5mmol/L化合物(Ⅰ)处理24h后，其凋亡率为25.5％；处理48h后，凋亡率上升至40.9％，多为早期凋亡；处理72h后，凋亡率为67.6％，多为晚期凋亡，细胞凋亡率随着处理时间延长而明显上升(表2)，各时间组之间凋亡率有统计学意义(P<0.01)。2.3用药组细胞随浓度变化凋亡情况处理72h后，2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mmol/L化合物(Ⅰ)组的细胞凋亡率分别为16％、24.2％、26.1％、66.3％、67.6％，且在药物浓度达到12.5mmol/L时，晚期凋亡率明显增大(表2)，各药物浓度组间凋亡率有统计学意义(P<0.01)。结论，本研究表明化合物(Ⅰ)具有诱导SACC-M凋亡的作用，且凋亡率随药物作用时间的延长和用药浓度的增加呈上升趋势。应用化合物(Ⅰ)治疗腺样囊性癌有可能成为一种很有前景的治疗方法。表1不同浓度不同作用时间抑制率(均值±SD)表2化合物(Ⅰ)诱导SACC-M凋亡情况浓度-时间正常细胞(％)早期凋亡(％)末期凋亡(％)损伤细胞(％)0mmol/L—24h93.20.54.91.40mmol/L—48h90.42.37.10.30mmol/L—72h87.56.16.10.212.5mmol/L—24h74.411.813.70.112.5mmol/L—48h5935.45.5012.5mmol/L—72h32.421.346.30.12.5mmol/L—72h82.41.514.51.75.0mmol/L—72h75.719.34.90.17.5mmol/L—72h73.915.210.9010.0mmol/L—72h33.658.77.60.1实施例3片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。实施例4口服液制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。实施例5胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。实施例6注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。实施例7无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 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