本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产α-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
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α-胡萝卜素可作为重要的维生素A原外，最近系列研究发现它还可有效抑制癌症转移，可作为癌症抗转移剂，或作为抗癌药物的佐剂。大部分植物和微生物中β-胡萝卜素积累较普遍，但α-胡萝卜素占有的比例较低。并且现有微生物合成主要针对β-胡萝卜素，尚未见在微生物中对α-胡萝卜素进行有效合成，商业途径获得的α-胡萝卜素价格非常昂贵，制作成本高。Sigma官方卖α-胡萝卜素纯度95％以上的价格为4389元/mg。另外，化学合成α-胡萝卜素存在较大的安全性问题，不适合应用于食品的开发。因此，利用生物合成法生产α-胡萝卜素是一条相对安全与有效的途径。
目前已有利用植物来源基因在酵母或大肠杆菌成功合成β-胡萝卜素和番茄红素，但还未见α-胡萝卜大量积累的工程菌，利用植物来源的基因构建α-胡萝卜素大量积累的工程菌是一条相对安全与有效的途径。
技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供一种香蕉番茄红素β-环化酶及其编码基因。
申请人研究发现与其他植物相比，香蕉果肉具有高比例的α-胡萝卜素(30-60％)积累特性。在植物代谢途径中α-胡萝卜素的合成需要番茄红素β-环化酶基因(LCYB)和番茄红素ε-环化酶基因(LCYE)两个基因的环化作用。
本发明的香蕉番茄红素β-环化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该香蕉番茄红素β-环化酶可环化δ-胡萝卜素形成α-胡萝卜素。
一种编码上述的香蕉番茄红素β-环化酶的香蕉番茄红素β-环化酶基因。优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供本发明的香蕉番茄红素β-环化酶在环化δ-胡萝卜素形成α-胡萝卜素中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种生产α-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法。
本发明的生产α-胡萝卜素的基因工程菌，是通过以下方法构建的，将上述的香蕉番茄红素β-环化酶基因与表达载体连接，然后转化到含有pAC-Delta质粒的工程菌中，得到生产α-胡萝卜素的基因工程菌。优选，所述的表达载体为表达载体pBluescript SK，所述的工程菌为大肠杆菌。
一种根据上述的构建方法构建得到的生产α-胡萝卜素的基因工程菌。
本发明的第四个目的是提供本发明的生产α-胡萝卜素的基因工程菌在制备α-胡萝卜素中的应用。
本发明的α-胡萝卜素的制备方法，其特征在于，所述的α-胡萝卜素是从生产α-胡萝卜素的基因工程菌的发酵培养物中制备得到的，具体包括以下步骤：将生产α-胡萝卜素的基因工程菌接入到LB培养基中，在28-37℃，振荡培养，得到生产α-胡萝卜素的基因工程菌的发酵培养物，对该发酵培养物进行离心去上清，得到菌体，然后用体积比为2:1的氯仿-甲醇进行萃取，有机相经干燥后得到α-胡萝卜素。
本发明利用在植物代谢途径中α-胡萝卜素的合成需要番茄红素β-环化酶(其氨基酸序列 如SEQ ID NO.2所示)和番茄红素ε-环化酶的环化作用，将香蕉番茄红素β-环化酶基因与表达载体连接，然后转化到含有pAC-Delta质粒的工程菌中，得到生产α-胡萝卜素的基因工程菌。
利用本发明的生产α-胡萝卜素的基因工程菌经发酵培养3d，α-胡萝卜素的产量可高达17.21mg/L。本发明的基因工程菌可直接从菌体中获得高纯度、高产量的α-胡萝卜素，可大量生产纯度较高的α-胡萝卜素，具有良好的应用前景。
附图说明：
图1是α-胡萝卜素的液相图，其中，图1中A为α-胡萝卜素标准品的液相图，图1中B为本发明制备的α-胡萝卜素的液相图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
申请人研究发现与其他植物相比，香蕉(Musa nana Lour.)可积累高比例的α-胡萝卜素，并从香蕉中克隆到可环化δ-胡萝卜素生成的α-胡萝卜素的香蕉番茄红素β-环化酶基因(MaLCYB)，因此构建该基因的表达载体，转入含有pAc-Delta质粒的工程菌中，获得可大量积累α-胡萝卜素的生产α-胡萝卜素的基因工程菌。
以下对实施例的具体步骤进行说明：
a)香蕉RNA的提取及cDNA的获得：
RNA提取采用CTAB的方法进行。具体步骤为：取1g用液氮磨碎的香蕉果实，加入4mL65℃预热的CTAB溶液(100mM Tris-HCl(pH 8.0)，2M NaCl，25mM EDTA，2％CTAB， 2％PVP，0.5g/L亚精胺(Spermidine))和70μLβ-巯基乙醇混匀，加入4mL的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃10000g离心15分钟，取上清，重复加入4mL的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃10000g离心15分钟，取上清，加入1/5体积的12M LiCl，混匀，于4℃放置过夜，4℃10000g离心30分钟，去上清，在透明或白色沉淀中加入400μL 65℃预热的SSTE溶液(1M NaCl，0.5％SDS，10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA)溶解，加入400μL氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃10000g离心10分钟，取上清，重复加入400μL氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋20秒，15℃10000g离心10分钟，取上清，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，-80℃放置1个小时，4℃10000g离心30分钟，去上清，加入DEPC水溶解RNA，提取得到香蕉RNA，保存于-80℃。
将香蕉RNA逆转录成cDNA用TAKARA公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒。取出-80℃冻存的香蕉RNA，待融化后，根据说明书加入DNA酶后，42℃2分钟消化DNA，再加入反转录试剂，37℃15分钟，85℃5秒；得到逆转录的cDNA。
b)香蕉番茄红素β-环化酶基因(MaLCYB)的克隆：
利用生物信息学分析方法，在香蕉基因组数据库中搜索番茄红素β-环化酶基因(MaLCY B)，得到1条候选序列，根据该序列信息，设计用于扩增香蕉番茄红素β-环化酶基因(MaL CYB)全长序列的引物序列为：上游引物MaLCYBF：5’-GGGCCCATGGATACGCTGCTTAG-3’和下游引物MaLCYBR：5’-GGATCCCTAATTTTTCTCTCG-3’。
反应体系参照说明书，PCR扩增用Takara的PrimeSTAR Max Premix(2×)10μL，10μM上游引物MaLCYBF和10μM下游引物MaLCYBR各0.5μL，逆转录的cDNA模板0.1μL， 加双蒸水补足20μL。PCR扩增程序为98℃30sec，1个循环；98℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，36个循环；72℃10min，1个循环。由此扩增得到香蕉番茄红素β-环化酶基因(MaLCYB)全长序列，全长序列经限制性内切酶ApaI和BamHI酶切后(37℃酶切反应2个小时)，连接到表达载体pBluescript SK(37℃限制性内切酶ApaI和BamHI酶切2个小时)中，得到重组质粒pMaLCYB，送公司测序，香蕉番茄红素β-环化酶基因(MaLCYB)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，确认序列正确后，利用热激法(42℃热激90秒)将该重组质粒pMaLCYB转入含有pAC-Delta质粒(购买于Addgene公司，货号#53273)(含有欧文氏菌的crtE，crtB，crtI基因和拟南芥的lcyE基因)的大肠杆菌DH5α中，于37℃在LB固体培养基(含34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)上培养1天，挑取阳性单克隆于1mL的LB液体培养基中(含34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)，28-30℃，200转/分钟培养1天，至OD600值为1.0左右，保存于15％的甘油，放于-80℃冰箱备用，由此得到的生产α-胡萝卜素的基因工程菌，经过培养后可积累大量的α-胡萝卜素。
其中，LB固体培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeast extract)，10g/L氯化钠(NaCl)，15～20g/L琼脂粉，用10M NaOH调整pH值到7.4，余量为水；121℃，灭菌30min，温度降至55℃左右(不烫手)时，加入34mg/L的氯霉素和50mg/L的氨苄青霉素，倒平板，保存备用；LB液体培养基的配方为：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母提取物(Yeast extract)，10g/L氯化钠(NaCl)，用10M NaOH调整pH值到7.4，余量为水；121℃，灭菌30min，温度降至55℃左右(不烫手)或冷却后，加入34mg/L的氯霉素和50mg/L的氨苄青霉素，保存备用。
c)α-胡萝卜素的鉴定
取20μL上述保存的生产α-胡萝卜素的基因工程菌接种到25mL LB液体培养基(含有34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)中，于28℃培养3天(摇床转速200rpm)。培养后，12000g离心10分钟，得到菌体，加入氯仿：甲醇(体积比2:1)进行萃取，涡旋2分钟，12000g离心5分钟，收集下层有机相，用氮吹仪将有机相吹干，得到化合物1。对化合物1进行液相色谱分析(图1)，化合物1的保留时间(图1中B)与α-胡萝卜素标准品的保留时间(图1中A)一致，因此，确定化合物1为α-胡萝卜素。
d)培养体系的筛选
取20μL上述保存的生产α-胡萝卜素的基因工程菌接种到25mL LB液体培养基(含有34mg/L浓度的氯霉素和50mg/L浓度的氨苄青霉素)中，分别于28℃、30℃和37℃培养1到4天(摇床转速200rpm)。培养后，12000g离心10分钟，得到菌体，加入氯仿：甲醇(体积比2:1)进行萃取，涡旋2分钟，12000g离心5分钟，收集下层有机相，用氮吹仪将有机相吹干，得到α-胡萝卜素。α-胡萝卜素的产量和纯度见表1，其中30℃下培养1天的α-胡萝卜素的产量为6.60mg/L，纯度达到95％以上，α-胡萝卜素的产量及纯度都较高，28℃培养3天的α-胡萝卜素的产量最高，为17.21mg/L，37℃培养效果最差。其中，LB液体培养基的配方与步骤b)中的LB液体培养基的配方相同。
表1不同培养体系下α-胡萝卜素的产量及纯度比较