本发明涉及水污染监测
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及一种用MSH6基因监测水中镉污染的方法。
背景技术：
：随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体重金属污染日益加剧，其中镉是重金属污染的典型代表。镉是一种银白色有光泽的金属，质软耐磨，抗腐蚀。自然界中的镉的形态有+1价，主要为+2价。镉的化合物基本都溶于水，只有硫化镉、氢氧化镉及硒化镉极难溶于水。在水溶液中易与氯离子、氨根离子及碳酸根离子等能发生络合反应。而且镉还可以与含有Se、S、N等的有机物形成中等稳定的络合物，尤其是能与含-SH基团的氨基酸类物质强烈螯合。因而镉具有较大的水溶性，更容易为生物所得和积累。镉毒性很强，镉在水体中不能被生物降解，只能在各种形态之间相互转化、分散和富集过程迁移。镉是水生动物非必需但高致毒元素，具有亲脂强、易富集和难降解的特性，不仅能引起动物肾、肝、睾丸损伤，肺水肿和骨软化，而且与肾、肺、前列腺的癌变等相关，对环境、人和其他动物健康造成严重威胁。用化学方法可以定性、定量检测镉等重金属污染，但是无法检测其危害性和危害程度。敏感生物标记物则可敏感地监测镉等重金属污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种用MSH6基因监测水中镉污染的方法，通过鱼的MSH6基因作为敏感生物标记物，测试并计算MSH6基因的相对表达量，能敏感的表达出水体中镉污染的程度，方法简单易操作能快速灵敏地检测出水体污染程度，更好的监测水体污染，使得污染能够及时治理。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用MSH6基因监测水中镉污染的方法；本发明提供的技术方案为：一种用MSH6基因监测水中镉污染的方法，用鱼作为监测水污染的生物样本，所述鱼的MSH6基因作为监测水中镉污染的敏感生物标记物。优选的是，建立鱼的MSH6基因的相对表达量2-△△Ct与污染浓度关系的标准曲线，获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的MSH6基因的相对表达量2-△△Ct与标准曲线比对，获得污染浓度。优选的是，计算MSH6基因的相对表达量具体包括以下步骤：1)用鱼作为监测水污染的生物样本；2)利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；3)用实时荧光定量PCR检测，以首链cDNA为模板，分别根据所述MSH6基因的特异性引物，所述内参基因18s-rRNA基因引物，在罗氏PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR反应体系为：SYBR试剂12.5μL、上游引物1μL、下游引物R1μL、cDNA2μL、灭菌蒸馏水8.5μL，反应体系总体积为25μL；反应程序采用三步法程序：95℃预变性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40个循环；采集荧光信号数值Ct；4)获得MSH6基因荧光信号数值CtMSH6和内参基因荧光信号数值Ct18s-rRNA后，采取2-△△Ct法进行数据分析，△Ct＝CtMSH6-Ct18s-rRNA，△△Ct＝(CtMSH6-Ct18s-rRNA)测试组-(CtMSH6-Ct18s-rRNA)空白组，MSH6基因的相对表达量＝2-△△Ct，计算2-△△Ct得出MSH6基因的相对表达量。优选的是，通过MSH6基因的相对表达量来监测水污染的程度，2-△△Ct值越大，污染程度越大，反之，2-△△Ct值越小，污染程度越小。优选的是，所述鱼为仔鱼，将仔鱼分成若干组，其中一组作为无污染对照组，其他组为待测水域组；分别将仔鱼放入无污染对照水体和待测水域水体中饲养；7天后随机抽取鱼样品，检测并计算MSH6相对表达量2-△△Ct，如果待测水域组的2-△△Ct值大于无污染对照组的2-△△Ct值，那么待测水域受到镉污染，其污染源镉的浓度与待测水域组的2-△△Ct值成正相关。优选的是，所述MSH6基因的特异性引物为：上游引物如SEQIDNO.1所示：MSH6-F：5’-AGGAGTCGGAAGTAGAAAGC-3’，下游引物如SEQIDNO.2所示：MSH6-R：5’-TCAGGCGAGACTTTGTGTTC-3’；所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：上游引物如SEQIDNO.3所示：18s-rRNA-F：5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’，下游引物如SEQIDNO.4所示：18s-rRNA-R：5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’。优选的是，所述鱼的MSH6基因的相对表达量与所述水中镉污染的浓度呈正相关。优选的是，所述鱼为海水青鳉或淡水青鳉。优选的是，所述仔鱼均为10天龄幼鱼。本发明至少包括以下有益效果：1)MSH6基因作为监测水污染的敏感生物标记物，测试MSH6基因的相对表达量，来监测水体污染的程度，该方法能灵敏反应出水体是否污染及污染程度，甚至能敏感的表达出微量污染源的水体污染；同时也能从生物的角度敏感地监测重金属镉污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。2)鱼的MSH6为修复蛋白6基因能敏感反应水中微量的镉污染，MSH6基因作为监测水污染的敏感生物标记物，同时MSH6相对表达量能敏感的表达出水中重金属镉的浓度呈正相关，该基因对其他污染源具有相对的稳定性，能单一准确表达出水中镉的污染，这样为监测、控制和治理水污染提供很便利的条件。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式结合下面实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例11、水污染鱼生物样本饲养准备采用海水青鳉仔鱼作为监测水污染的生物样本，将仔鱼分成10组，每组3个平行进行养鱼实验，各组分别在表1所述的镉浓度水体中饲养，其中0浓度的作为无污染对照组，饲养7天后随机采集各组鱼样品测定。饲养7天后，每个平行取3尾鱼样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组鱼的MSH6基因的相对表达量结果。表110组仔鱼饲养的水体镉浓度实验序号对照组123456789镉浓度(μg/L)0801602403204004805606407202、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；(1)快速称取冷冻的幼鱼100mg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研钵中倒入液氮，用研杵研磨称量好的幼鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不锈钢小药匙迅速将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。(2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mLRNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离心管中。然后再向匀浆管中加入0.2mLRNAiso试剂，洗涤匀浆棒和匀浆管管壁一次，之后将匀浆液转入之前的离心管中，重复上述操作一次，使加入的RNAiso试剂总体积为1mL。盖好离心管并颠倒混匀数次后室温静置5min。(3)用1000μL微量移液枪往上一步的1.5mL离心管中加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，混匀至溶液乳化后，再室温静置5min。(4)转移至高速冷冻离心机中12000g，4℃，离心15min。(5)小心从离心机中取出离心管，用1000μL微量移液器吸取500μL上清液至一个新的1.5ml离心管中。(6)然后往新的1.5mL离心管中加入500μL异丙醇，盖好离心管并充分颠倒混匀，室温静置10min。(7)转移至高速冷冻离心机中12000g，4℃，离心10min。(8)将1.5mL离心管中上清液倒掉，再12000g，4℃，离心1min，用小枪头(100μL)将上清液吸净。(9)往离心管中加入现配的预冷的75％乙醇1ml(无水乙醇3：1DEPC水)，盖好离心管并轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁及RNA，再12000g，4℃，离心1min后小心去除乙醇。(10)在超净工作台中打开离心管盖，室温干燥沉淀10min，加入50μLDEPC处理水溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20℃冰箱保存，待用。(11)使用ThermoScientificNanodrop2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓度，RNA含量的计算公式：样品RNA浓度(μg/mg)＝测定浓度(ng/μl)×50×1000÷M。(12)用1％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的OD260/OD280值在1.9～2.1之间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5S三条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；(13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；a)逆转录：用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表2配制反转录反应液。表2反转录反应液组成反应液配制方法：配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量，统一加入无菌离心管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小心点动离心混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，反转录反应条件：50℃，20min→95℃，5min→5℃，5min→15℃，15min。3、用实时荧光定量PCR检测目的基因(1)引物设计所述Shh基因的特异性引物为：上游引物为：MSH6-F：5’-AGGAGTCGGAAGTAGAAAGC-3’，(SEQIDNO.1)下游引物为：MSH6-R：5’-TCAGGCGAGACTTTGTGTTC-3’；(SEQIDNO.2)所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：上游引物为：18s-rRNA-F：5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’，(SEQIDNO.3)下游引物为：18s-rRNA-R：5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’；(SEQIDNO.4)(2)PCR检测目的基因PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表3配制PCR反应液：表3PCR反应液组成根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离心混匀，然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离心混匀。反应结束后，将PCR管保存于4℃冰箱保存，待用。PCR扩增反应条件：95℃，1min→(94℃，30sec→60℃，30sec→72℃，1min40个循环)→72℃，5min→15℃，pause。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单一，出现位置在100bp-200bp之间，可初步确定PCR产物为目的基因。PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对后，确定PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的荧光定量实验。本实验采用的是TaKaRa公司的PremixExTaqTM(PerfectRealTime)试剂盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DNA的过程中，荧光分子GreenI与双链DNA结合能够发出荧光信号，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号的强弱变化，来及时分析目的基因MSH6的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时荧光定量PCR的反应体系如表4：表4RTQ-PCR反应体系组成RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离心混匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，以避免污染，而且配制的速度要快，以免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离心机短暂离心，确保试剂沉积在管底。荧光定量反应条件：95℃预变性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40个循环；采集荧光信号数值Ct；获得MSH6基因荧光信号数值CtMSH6和内参基因荧光信号数值Ct18s-rRNA后，采取2-△△Ct法进行数据分析，△Ct＝CtMSH6-Ct18s-rRNA，△△Ct＝(CtMSH6-Ct18s-rRNA)测试组-(CtMSH6-Ct18s-rRNA)空白组，MSH6基因的相对表达量＝2-△△Ct，计算2-△△Ct得出MSH6基因的相对表达量；测定并经数理统计的结果如表5所示：表510组鱼样品的MSH6基因的相对表达量2-△△Ct实验序号对照组123456789镉浓度(μg/L)080160240320400480560640720MSH62-△△Ct1.371.451.591.802.172.723.294.084.655.49受到水域中重金属镉的污染胁迫，鱼样本生理机能发生变化，通过MSH6基因的相对表达量来监测水污染的程度，2-△△Ct值越大，重金属镉浓度大，很直观的说明水域受污染的程度越大，反之2-△△Ct值越小，重金属镉浓度越小，说明水域受污染的程度越小，测试组的2-△△Ct值大于对照组的2-△△Ct值时说明水体已经受镉污染，而且2-△△Ct值越大污染越严重。通过表5的数据结构建立鱼的MSH6基因的相对表达量2-△△Ct与镉浓度关系的标准曲线，获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的MSH6基因的相对表达量2-△△Ct与标准曲线比对，获得镉浓度大小。实施例21、水污染鱼生物样本饲养准备采用10天龄海水青鳉仔鱼作为监测水污染的生物样本，将仔鱼分成2组，每组3个平行进行养鱼实验，这2组分为无污染对照组与待测水域组，将仔鱼分别放入无污染水体和待测水域水体中饲养，7天后，每个平行随机取3尾鱼样品测定，每组测定3x3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组鱼的结果；2、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；(1)快速称取冷冻的幼鱼100mg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研钵中倒入液氮，用研杵研磨称量好的幼鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不锈钢小药匙迅速将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。(2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mLRNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离心管中。然后再向匀浆管中加入0.2mLRNAiso试剂，洗涤匀浆棒和匀浆管管壁一次，之后将匀浆液转入之前的离心管中，重复上述操作一次，使加入的RNAiso试剂总体积为1mL。盖好离心管并颠倒混匀数次后室温静置5min。(3)用1000μL微量移液枪往上一步的1.5mL离心管中加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，混匀至溶液乳化后，再室温静置5min。(4)转移至高速冷冻离心机中12000g，4℃，离心15min。(5)小心从离心机中取出离心管，用1000μL微量移液器吸取500μL上清液至一个新的1.5ml离心管中。(6)然后往新的1.5mL离心管中加入500μL异丙醇，盖好离心管并充分颠倒混匀，室温静置10min。(7)转移至高速冷冻离心机中12000g，4℃，离心10min。(8)将1.5mL离心管中上清液倒掉，再12000g，4℃，离心1min，用小枪头(100μL)将上清液吸净。(9)往离心管中加入现配的预冷的75％乙醇1ml(无水乙醇3：1DEPC水)，盖好离心管并轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁及RNA，再12000g，4℃，离心1min后小心去除乙醇。(10)在超净工作台中打开离心管盖，室温干燥沉淀10min，加入50μLDEPC处理水溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20℃冰箱保存，待用。(11)使用ThermoScientificNanodrop2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓度，RNA含量的计算公式：样品RNA浓度(μg/mg)＝测定浓度(ng/μl)×50×1000÷M。(12)用1％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的OD260/OD280值在1.9～2.1之间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5S三条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；(13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA；a)逆转录：用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表2配制反转录反应液。表2反转录反应液组成反应液配制方法：配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量，统一加入无菌离心管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小心点动离心混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，反转录反应条件：50℃，20min→95℃，5min→5℃，5min→15℃，15min。4、实时荧光定量PCR检测目的基因(1)引物设计所述Shh基因的特异性引物为：上游引物为：MSH6-F：5’-AGGAGTCGGAAGTAGAAAGC-3’，(SEQIDNO.1)下游引物为：MSH6-R：5’-TCAGGCGAGACTTTGTGTTC-3’；(SEQIDNO.2)所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：上游引物为：18s-rRNA-F：5’-TTGACCCAACACGGGAAACCT-3’，(SEQIDNO.3)下游引物为：18s-rRNA-R：5’-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3’；(SEQIDNO.4)(2)PCR检测目的基因PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表3配制PCR反应液：表3PCR反应液组成根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离心混匀，然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离心混匀。反应结束后，将PCR管保存于4℃冰箱保存，待用。PCR扩增反应条件：95℃，1min→(94℃，30sec→60℃，30sec→72℃，1min，40个循环)→72℃，5min→15℃，pause。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单一，出现位置在100bp-200bp之间，可初步确定PCR产物为目的基因。PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对后，确定PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的荧光定量实验。本实验采用的是TaKaRa公司的PremixExTaqTM(PerfectRealTime)试剂盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DNA的过程中，荧光分子GreenI与双链DNA结合能够发出荧光信号，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号的强弱变化，来及时分析目的基因MSH6的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时荧光定量PCR的反应体系如表4：表4RTQ-PCR反应体系组成RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离心混匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，以避免污染，而且配制的速度要快，以免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离心机短暂离心，确保试剂沉积在管底。荧光定量反应条件：95℃预变性30s；95℃15s→60℃30s→72℃30s，40个循环；采集荧光信号数值Ct；采用上述参数，多次循环测试，相对其他参数来说采集到的荧光信号数值Ct误差小；获得MSH6基因荧光信号数值CtMSH6和内参基因荧光信号数值Ct18s-rRNA后，采取2-△△Ct法进行数据分析，△Ct＝CtMSH6-Ct18s-rRNA，△△Ct＝(CtMSH6-Ct18s-rRNA)测试组-(CtMSH6-Ct18s-rRNA)空白组，MSH6基因的相对表达量＝2-△△Ct，计算2-△△Ct得出MSH6基因的相对表达量，采取2-△△Ct法进行数据分析能减少误差，能够准确表述MSH6基因的相对表达量从而精准反映出水污染程度；检测结果：对照组的2-△△Ct值为2.68，待测组的2-△△Ct值为3.25，结果显示对照组的2-△△Ct值小于待测组的2-△△Ct值，所述待测水域已经受到了重金属镉污染，需及早进行水域治理，并且生物监测水污染的同时也能表达出污染对生物体的危害程度，而化学的方法测试镉一般采用原子分光光度计法测试，原子分光光度计法先做标准曲线，然后制作样品再测试样品的吸光度后，在标准曲线上找去相应浓度，该方法误差大，并且只适合较大浓度测试，微量级浓度无法测试出。本发明所提到的空白组为所使用的试剂盒的空白对照，目的是为了减小误差。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地改作他用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页1 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