一种利用新微生物菌株降解土壤中三唑醇的方法与流程

本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一种利用新的微生物菌株，降解被三唑醇污染土壤的方法。

背景技术：

三唑醇是德国拜尔公司开发的一种三唑类杀菌剂，由于其具有高效、广谱、残效期长和内吸传导性强等特性，对作物具有保护和治疗作用,广泛应用于水果和禾谷类等农作物上。三唑醇本身是杀菌剂，又是三唑酮的主要代谢产物，具有神经毒性，对啮齿类动物胚胎咽部形态有一定影响，能够通过改变正常后脑发育模式使小鼠胚胎发生严重畸形，有致畸作用。不同浓度的三唑醇对人肝细胞具有不同毒性：低浓度时，显著促进细胞增殖，并且随着浓度的增大，促进作用增大；在高浓度时，显著抑制细胞的增殖，当浓度大于222.584μg/mL时，细胞全部死亡。三唑醇在pH4～7(20℃和40℃)条件下十分难水解(very persistent)，降解半衰期＞250天，在土壤中降解半衰期为47.3-250天，属于在土壤中比较难降解的农药(http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/en/index.htm)，随着其大量使用，势必会导致其在土壤中残留，因此极容易造成在农产品中超标，进而对人体健康和国际贸易产生影响。目前欧盟和日本已对该农药在食品中的残留量作出了严格的限制，如日本肯定列表规定多数食品中三唑醇的残留量不得超过0.1mg/kg。2007年1月欧盟公布了进口的中国产蜂蜜中检测出三唑醇残留量超标的预警通报。同年由于辣椒中三唑醇超标，出口日本的农产品被扣押。2010年至今，我国出口日本的胡萝卜每年均有因三唑醇超标而被扣押的事件发生。因此，三唑醇残留引起的农产品安全问题亟待解决。

与物理和化学去除技术相比，生物降解技术具有经济性强、二次污染少，去除效率高等显著优点，是迄今为止处理环境和农产品污染一种较好的方法，具有广阔的应用前景。介质中微生物的选择性降解是环境中农药的主要降解途径。但目前还没有有关微生物降解三唑醇的报道。

技术实现要素：

本发明目的是，针对目前三唑醇残留问题，提供一种降解三唑醇效能较高的新微生物菌株；其次是提供一套利用该菌株快速、高效降解污染土壤中三唑醇的方法。

以下是本发明技术方案的详细描述。

微生物菌株的筛选与鉴定：

本发明从江苏省某农药厂取土样8份，取完后在48h之内迅速筛选菌种，筛选的具体方法是：将样品在含三唑醇的富集培养基中逐步富集培养后，再在含三唑醇的无机盐培养基中驯化2-5次，然后涂布于普通培养基平板上进行分离、纯化；最后经过液体培养基中的降解试验，最终得目标菌株E-9。

本发明筛选得到的菌株E-9，委托武汉大学中国典型培养物保藏中心对其进行16S rRNA基因序列的测定与分析、菌株的形态观察、生理生化特性鉴定。根据上述结果确定该菌株为木糖氧化无色小杆菌(Achromo bacterxylosoxidans)，革兰氏阴性。

生物样品材料保藏：木糖氧化无色小杆菌(Achromo bacterxylosoxidans)菌株E-9已于2016年6月24日保存在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016348。

根据以上微生物学特征鉴定，该新菌株E-9属于木糖氧化无色小杆菌(Achromo bacterxylosoxidans)，该株微生物不属于现己公开专利菌种的任何一种，该株微生物具有降解三唑醇的能力，可以用于土壤中三唑醇的降解。

一种利用新微生物菌株降解土壤中三唑醇的方法，该方法按以下步骤进行：

(1)普通培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，经灭菌后，备用；

(2)菌种发酵培养基：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，经灭菌后，备用；

(3)种子液的制备：挑取1环木糖氧化无色小杆菌(Achromo bacterxylosoxidans)斜面保藏菌株E-9CCTCC NO:M 2016348，接入步骤(1)培养基，于30℃、180rpm条件下振荡培养24h后得到种子液，备用；

(4)降解菌剂的制备：将步骤(3)种子液按体积5％接种量接入步骤(2)培养基中；于30℃、180rpm条件下振荡培养48h后得到降解菌剂，备用；

(5)降解菌剂对土壤中三唑醇的降解：将步骤(4)降解菌剂与含三唑醇的土壤样品按重量1︰10的比例，混匀，利用菌体降解7-45d；

(6)土壤样品三唑醇残留量的测定：采用高效液相色谱方法对步骤(4)经菌体降解后的土壤样品进行三唑醇残留量的测定；土壤样品用100mL丙酮/蒸馏水(V/V，5/1)振荡提取2h后过滤，滤渣用40mL丙酮/蒸馏水(V/V，5/1)分3次洗涤，合并滤液于旋转蒸发仪上减压抽去丙酮。浓缩液中加入50mL饱和氯化钠水溶液，依次用50、40和30mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，浓缩至2mL左右。玻璃层析柱内依次加入2g无水硫酸钠、6g弗罗里硅土和2g无水硫酸钠，将提取液转移至柱内，用50mL二氯甲烷/丙酮(V/V＝9/1)淋洗，收集洗脱液，浓缩至1mL，用甲醇定容至10mL，进行高效液相色谱仪检测条件：检测波长223nm，流动相为甲醇：水(V:V＝70:30)，流速为0.8mL/min，采用SUPELCO C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，进样量为20μL，柱温为25℃。三唑醇的出峰时间为7.12min，可测定出样品中三唑醇的含量，并计算出菌种对三唑醇的降解率。

所述的方法，其中所述降解菌剂发酵培养基的组分与各组分的重量百分比含量为：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

所述的方法，其中所述培养条件为：温度30℃，初始pH为7.0，在搅拌、通风、振荡条件下培养48h。

生物材料保藏信息

木糖氧化无色小杆菌(Achromo bacterxylosoxidans)菌株E-9，保存在武汉中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2016348，保藏日期为：2016年6月24日。

有益效果

一、本发明从微生物群中筛选得到可降解三唑醇的木糖氧化无色小杆菌E-9：CCTCC NO:M 2016348，其在适合条件下，能有效降解三唑醇。

二、本发明将木糖氧化无色小杆菌E-9用于土壤中三唑醇的降解实验，结果表明，该菌可有效降解土壤中的三唑醇，30天时对土壤中三唑醇的降解率可达56％，45天时对土壤中三唑醇的降解率可达66％(见实施例3、4、5、6)，因此该菌在降解土壤中三唑醇的领域中具有较广泛的应用前景。

说明书附图说明

图1为本发明筛选的E-9菌株显微镜(1000X)观察照片。

图2为本发明筛选的E-9菌株的平板菌落形态结果图。

图3为本发明筛选的E-9菌株的电镜照片。

图4为菌株E-9降解土壤中三唑醇的效果比较图(实施例子3).

图5为菌株E-9降解土壤中三唑醇的效果图(实施例子4)。

图6为菌株E-9降解土壤中三唑醇的效果图(实施例子5)。

具体实施方案

通过下面实施例旨在对本发明作进一步的详细说明，而不是限制本发明的范围。以下实施例中采用的：

微生物：为木糖氧化无色小杆菌E-9CCTCC NO:M 2016348；

三唑醇：美国Sigma公司，纯度为98.5％

实施例1：新菌株E-9的筛选

本发明从浙江省某农药厂采集曝气池活性污泥，在24h之内迅速从中筛选菌种；筛选的具体方法是：称取10g活性污泥，置于100mL富集培养基中，同时分别添加100g/L的三唑醇原药0.1mL使其终浓度为100mg/L，并于30℃，180r.min^-1摇床培养，以后每7d移种一次，以10％的接种量接入新鲜培养基中，并以100mg/L为提高单位逐渐提高供试农药的浓度至600mg/L。然后将培养液加入以供试农药三唑醇(600mg/L)为唯一碳源的无机盐培养基中驯化2-5次，每次7d，最后用涂抹法在普通培养基上进行分离。选取生长快，菌落规则，传代稳定的菌落，在普通培养基平板上纯化2或3次，镜检为单一形态后得到初筛菌株。将初筛菌株在降解培养基中进行降解性能测试，根据三唑醇的降解率大小，从中筛选出降解能力显著的菌株E-9，作为进一步研究的出发菌株；

所述富集培养基配方为：向普通培养基中加入不同质量浓度的三唑醇溶液，使其最终的三唑醇质量浓度分别为100、200、300、400、500、600mg/L；

所述驯化无机盐培养基为：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蒸馏水1000mL，pH值7，三唑醇600mg/L；

所述发酵培养基配方为：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

实施例2：新菌株E-9的鉴定

对实施例1筛选得到的菌株E-9委托武汉大学菌种保藏中心进行微生物菌株16S rRNA基因序列的测定与分析、菌株的形态观察、微生物菌株的生理生化特性鉴定。根据上述检测结果，菌株E-9鉴定为木糖氧化无色小杆菌(Achromo bacterxylosoxidans)，革兰氏阴性，此株菌已于2016年6月24日保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016348。

菌株E-9CCTCC NO:M 2016348 16S rRNA基因序列:

GGCACGATCTACGTGGTATCGCCCCCCTTGCGGTTAGGCTAACTACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGACATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGGTTTCTGGGATTGGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCGACCCTCTGTCCCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCTTTCGTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCCGGTTCTCTTGCGAGCACTGCCAAATCTCTTCGGCATTCCAGACATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTGCGCTACCAAGGCCCGAAGGCCCCAACAGCTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTGTTATCCCAGGAGGCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCGCATATCTACGCATTTCACTGCTACACGCGGAATTCCACCTCCCTCTGACACACTCTAGCCCGGTAGTTAAAAATGCAGTTCCAAAGTTAAGCTCTGGGATTTCACATCTTTCTTTCCGAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCAGGTACCGTCAGTTTCGCGGGGTATTAACCCACGACGTTTCTTTCCTGCCAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCGCACACGCGGGATGGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTCCTCTCAAACCAGCTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGATATCGGCCGCTCCAATAGTGCAAGGTCTTGCGATCCCCTGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCTACGCTTTCGCGTAGTTATCCCCCGCTACTGGGCACGTTCCGATACATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGACCGAAGTCCGTGCTGCCGTTCGACTGCATG

表1菌株E-9生理生化特性–酶活、碳源同化

+：阳性反应；-：阴性反应

表2菌株E-9生理生化特性—利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应

实施例3：利用菌株E-9降解土壤中三唑醇的方法1

按以下步骤进行：

(1)菌种活化培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。经灭菌后，备用；

(2)菌种发酵培养基：(NH₄)₂SO₄ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，CaSO₄ 0.08g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.0033g，MgSO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，蔗糖3.0g，蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。经灭菌后，备用；

(3)种子液的制备：挑取1环木糖氧化无色小杆菌(Achromo bacterxylosoxidans)斜面保藏菌株E-9CCTCC NO:M 2016348，接入步骤(1)培养基，于30℃、180rpm条件下振荡培养24h后得到种子液，备用；

(4)降解菌剂的制备：将步骤(3)种子液按体积5％接种量接入步骤(2)培养基中；于30℃、180rpm条件下振荡培养48h后得到降解菌剂，备用；

(5)将步骤(4)降解菌剂以10％的比例分别加入含有5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg三唑醇的土壤样品中，加入无菌水，保持土壤湿度在田间持水量的60％左右，充分混匀，使三唑醇和菌剂分布均匀。按时补加无菌水，尽量保持土壤湿度在田间持水量的60％左右，以添加同等质量浓度三唑醇不加菌剂土壤样品为对照。30℃下避光降解7天；测定7天时土壤中三唑醇残留量。

(6)土壤样品三唑醇残留量的测定：采用高效液相色谱方法对步骤(5)的土壤样品进行三唑醇残留量的分析，土壤样品用100mL丙酮/蒸馏水(V/V,5/1)振荡提取2h后过滤，滤渣用40mL丙酮/蒸馏水(V/V＝5/1)分3次洗涤，合并滤液于旋转蒸发仪上减压抽去丙酮。浓缩液中加入50mL饱和氯化钠水溶液，依次用50、40和30mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，浓缩至2mL左右。玻璃层析柱内依次加入2g无水硫酸钠、6g弗罗里硅土和2g无水硫酸钠，将提取液转移至柱内，用50mL二氯甲烷/丙酮(V/V＝9/1)淋洗，收集洗脱液，浓缩至1mL，用甲醇定容至10mL，进行高效液相色谱仪检测条件：检测波长223nm，流动相为甲醇：水(V:V)＝70:30，流速为0.8mL/min，采用SUPELCO C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，进样量为20μL，柱温为25℃。三唑醇的出峰时间为7.12min。经测定0天时不同三唑醇添加土壤样品(5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)中三唑醇含量分别为4.79mg/kg、24.31mg/kg、48.12mg/kg，7天对照土壤样品中三唑醇残留量分别为4.63mg/kg、23.40mg/kg、47.60mg/kg，接菌剂土壤样品中三唑醇残留量分别为3.40mg/kg、17.89mg/kg、36.56mg/kg，按菌种降解率(％)＝(未接种的土壤三唑醇含量-接种土壤三唑醇含量)/未接种的土壤三唑醇含量*100的公式计算，对照土壤中三唑醇降解率分别为3.34％、3.74％、1.08％，菌剂对三唑醇的降解率分别为29.03％、26.41％、24.02％，详见图4。

实施例4：利用菌株E-9降解土壤中三唑醇的方法2

(1)菌种活化培养基：同实施例3；

(2)菌种发酵培养基：同实施例3；

(3)种子液的制备：同实施例3；

(4)降解菌剂的制备：同实施例3；

(5)将步骤(4)降解菌剂以10％的比例分别加入含有5mg/kg三唑醇的土壤样品中，加入无菌水，保持土壤湿度在田间持水量的60％左右，充分混匀，使三唑醇和菌剂分布均匀。按时补加无菌水，尽量保持土壤湿度在田间持水量的60％左右，以添加同等质量浓度三唑醇不加菌剂土壤样品为对照。30℃下避光降解30d；当天采样，测定三唑醇原始沉积量，以后定期采样，测定三唑醇残留量。

(6)土壤样品三唑醇残留量的测定：测定方法同实施例3；经测定30天对照土壤样品中三唑醇含量为4.32mg/kg，30天接种土壤样品中三唑醇残留量为3.65mg/kg，按菌种降解率(％)＝(未接种的土壤三唑醇含量-接种土壤三唑醇含量)/未接种的土壤三唑醇含量*100的公式计算，该菌剂对三唑醇的降解率为24.46％，详见图5。

实施例5：利用菌株E-9降解土壤中三唑醇的方法3

(1)菌种活化培养基：同实施例3；

(2)菌种发酵培养基：同实施例3；

(3)种子液的制备：同实施例3；

(4)降解菌剂的制备：同实施例3；

(5)土壤加富营养液：葡萄糖3g、蛋白胨0.5g，蒸馏水1000mL，灭菌，备用。

(6)将步骤(4)降解菌剂以10％的比例分别加入含有25mg/kg三唑醇的土壤样品中，加入步骤(5)土壤加富营养液，保持土壤湿度在田间持水量的60％左右，充分混匀，使三唑醇和菌剂分布均匀。按时补加无菌水，尽量保持土壤湿度在田间持水量的60％左右，以添加同等质量浓度三唑醇不加菌剂土壤样品为对照。30℃下避光降解45d，在21d时剩下的处理二次加入相同量的菌剂及土壤加富营养液；当天采样，测定三唑醇原始沉积量，以后定期采样，测定三唑醇残留量。

(6)土壤样品三唑醇残留量的测定：测定方法同实施例3；经测定0d土壤样品中三唑醇含量为24.69mg/kg，30d、45d对照土壤样品中三唑醇含量分别为为22.56mg/kg、22.02mg/kg，接菌剂土壤样品中三唑醇残留量分别为10.74mg/kg、8.31mg/kg，经计算，对照土壤中30d、45d三唑醇降解率分别为8.63％、10.81％；E-9菌剂处理土壤中三唑醇降解率为56.31％、66.21％，详见图6。

实施例6：菌株E-9对培养液中三唑醇降解效果的测定

(1)菌种活化培养基：同实施例3；

(2)菌种发酵培养基：同实施例3；

(3)种子液的制备：同实施例3；

(4)降解菌剂的制备：同实施例3；

(5)降解菌剂对三唑醇降解：取步骤(2)发酵培养基，接入步骤(4)降解菌剂，接种量为10％(v/v)，向发酵培养基中添加三唑醇使终浓度为50mg/L，于30℃、180r/mint件下摇床培养培养7d；另设含有50mg/L三唑醇不接菌剂发酵培养基为对照；

(4)发酵培养基中三唑醇残留量的测定：从步骤(5)摇瓶中分别取发酵培养液按以下方法进行测定：发酵培养液用移液管吸取10mL于分液漏斗中，加入饱和氯化钠水溶液10mL，用二氯甲烷萃取三次(30mL×3)，收集二氯甲烷相，合并二氯甲烷相过无水硫酸钠，在旋转蒸发仪上(40℃水浴)减压浓缩近干，吹干，甲醇(色谱醇)10mL定容10ml，再稀释10倍后进行高效液相色谱分析。检测条件同实施例3。测定样品中三唑醇的残留量，并计算降解率，经测定对照中三唑醇含量为48.12mg/L，接种E-9降解菌剂样品中三唑醇残留量为18.34mg/L，经计算，确定菌剂对发酵培养基中三唑醇降解率为61.89％。

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