一种天贝生产菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种培养发酵制品的微生物，特别是涉及一种新的天贝生产菌株及利用该菌株在大豆发酵生产天贝方面的应用。

背景技术：
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天贝(Tempeh)又称为丹贝、天培，是通过对蒸煮的大豆进一步发酵而形成的豆制品。

发酵优良的天贝，风味口感佳、营养价值高、富含高活性的异黄酮苷元、多种游离氨基酸、不饱和脂肪酸、B族维生素、生育酚和抗氧化剂超氧化物歧化酶(SOD)等营养物质；研究表明，这些物质对于防治肥胖、糖尿病、高血脂、高血压和心脑血管病均有明显的作用。由于天贝具备上述优点，且其制作方法简易、生产成本低等，使其在欧美等发达国家广泛发展并深受喜爱。

我国是大豆生产和消费大国，但是目前市场上主要是豆浆、豆腐和豆粉等大豆初加工产品，而高营养价值、高附加值的天贝产品并未实现市场化销售。

天贝发酵过程所依赖的发酵菌株是霉菌，其中最常见的是少孢根霉菌(Rhizopous oligosporus)。但用少孢根霉菌发酵生产天贝所需时间较长，通常约需要48小时。

目前真正可用于产业化生产天贝产品的发酵菌株却非常匮乏。因此，发现高活性的天贝发酵菌株，进行最佳发酵条件的摸索，提供优良的天贝制作工艺，得到高质量(如外观、质地、气味及口感风味)的天贝产品，很有意义。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种新的高活性天贝生产菌株。

本发明的另一个目的是提供一种利用该新菌株生产天贝产品的方法。

发明人从一种“干豆豉”中分离到了一种真菌，经鉴定为无接合孢子根霉菌(R.azygosporus)LT0229，该菌株属于根霉属真菌，已于2016年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12164，以下简述为LT0229。

LT0229的形态特征为：

无接合孢子根霉LT0229在PDA综合培养基上会长出白色杆状菌体和白色菌丝体，随后，菌丝体上长出褐色孢子囊，囊柄基部带有匍匐枝和假根状分枝，孢子囊壁破裂后会散 落出圆形或椭圆形的灰黑色孢子。菌体生长形态见图1所示。

提取LT0229的基因组，以NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)为引物，扩增18S rDNA的序列，该18S rDNA序列如序列表所示。通过NCBI数据库进行Blast序列比对，发现LT0229与无接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)CBS357.93的相似度最高，相似度为100％。从NCBI数据库中选取了与LT0229相似度≧99％的前17种菌株进行了系统进化树分析，结果如图2所示。该结果显示LT0229与无接合孢子根霉菌(R.azygosporus)CBS357.93的进化距离非常近，处于同一分支中，故初步鉴定LT0229为无接合孢子根霉(R.azygosporus)。

结合菌株培养特征观察及18S rDNA的鉴定结果，参照《根霉菌鉴定手册》初步鉴定为无接合孢子根霉。

LT0229的培养方式为：在PDA综合培养基上、25-30℃静置，或者在PDB综合培养液中25-30℃震荡培养3-7天。

经实验证实：LT0229生产繁殖速度快，可以在短时间内(35h)生产出天贝产品。极大地节约了生产时间和能耗。

本发明通过对各种发酵条件的摸索，如研究适宜的发酵温度、pH和发酵时间等，得到了利用LT0229生产天贝的工艺方法，其步骤如下：

大豆原料精选→清洗→浸泡→去皮→蒸煮→加淀粉→沥水→加白醋→接菌→装袋→扎孔→发酵→杀菌。

所述无接合孢子根霉LT0229的接种量无特别限制，一般为10⁵～10⁷个孢子/mL筛选培养基。

本发明固体发酵所用的原料为精选大豆，发酵温度为25～30℃，优选最适温度为28～30℃。

本发明所用pH为4-5，优选pH4.5。

所述天贝制备方式为：静置培养32～48h，优选35h。

由无接合孢子根霉LT0229发酵产生的发酵制品也属于本专利的保护范围，所述发酵制品可以是发酵产品本身，也可以是以发酵产品为原料的深加工产品或从发酵产品中分离提取的营养成分。

天贝制备工艺研究证实，无接合孢子根霉菌(R.azygosporus)LT0229发酵生产天贝的周期短，所得发酵制品的品质优良：大豆接种该无接合孢子根霉菌35小时后便在大豆表面和内部形成均匀白色的菌丝粘膜，所得天贝制品具有发酵酱香味，无氨味，该天贝制品可鲜食、凉拌、作为佐菜烹饪或者进一步加工成休闲食品和分离提取功能成分(图3)。

本发明的无接合孢子根霉菌LT0229的优点如下：

1、发酵周期短，35小时即可发酵生产天贝，少于市场少孢根霉菌发酵生产天贝所需的48小时。

2、发酵所得天贝品质好，具有发酵酱香味，没有氨臭味；少孢根霉等天贝菌株由于发酵时间较长，容易产生孢子，使得产品出现黑斑，进而影响品质。

因此，无接合孢子根霉LT0229是理想的天贝制作菌株，并具有产业化大规模生产能力，且在食品、保健品和医药治疗等领域均具有广阔的市场前景。

附图说明：

图1为无接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229的菌体形态的光学显微镜图；

图2为无接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229的系统进化树图；

图3为无接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229对大豆进行发酵后的天贝制品形态图。生物材料保藏信息：

名称：无接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)LT0229

保藏编号：CGMCC No.12164

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏时间：2016年3月1日

保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。

实施例1无接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)LT0229的分离筛选

通过对孢囊柄特征和适宜生长的温度范围将天贝发酵菌株分离出来，分离样品来自湖南株洲国强湘菜特制加工厂生产的“干豆豉”中。取5g干豆豉溶于20ml无菌水中，加入玻璃珠于30℃摇床振摇30min，取1ml上清液并接种至20ml PDB液体培养基中，在30℃、180rpm下，振荡培养至有菌丝球生成，挑取菌丝球至另一盛有20ml新鲜PDB培养基的三角瓶中培养5天，取富集后的菌体做一系列的梯度稀释，取稀释浓度为1.0×10⁷CFU/mL的菌液涂布PDA平板，倒置30℃恒温培养，分离能够旺盛生长的菌株。用接种环从PDA平板挑取少量该菌株的孢子，继续在PDA平板上传代培养2-3次。用接种环将得到的纯菌种接种到PDA斜面培养基上培养，4℃保存备用。

实施例2无接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)LT0229的菌种鉴定

对纯化出的菌株的表型特征、培养特征和18S rDNA进行系统鉴定，结果如下：

培养特征及表型观察：

将分离纯化后的菌株接种到PDA培养基上培养，随时观察菌体生长状态。在PDA培养基上培养1天便可长出白色菌丝体，随后菌丝体上开始长出褐色孢子囊，囊柄基部带有匍匐枝和假根状分枝，随后孢子囊壁开始破裂，散落出圆形或椭圆形的灰黑色孢子。菌体生长过程的形态如图1所示。

鉴定结果：

提取LT0229的基因组，以NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)为引物，PCR扩增获得18S rDNA序列，测序结果如序列表所示。通过NCBI数据库进行Blast序列比对，发现LT0229与无接合孢子根霉(R.azygosporus)CBS357.93的相似度最高，相似度为100％。从NCBI数据库中选取了与LT0229相似度≧99％的前17种菌株进行了系统进化树分析，结果如图2所示。该结果显示LT0229与无接合孢子根霉菌(Rhizopus azygosporus)CBS357.93的进化距离最近，确实处于同一分支中，故初步鉴定LT0229为无接合孢子根霉(R.azygosporus)。

根据菌株培养特性、形态观察及18S rDNA的鉴定结果，参照《根霉菌鉴定手册》初步鉴定为无接合孢子根霉。

实施例3无接合孢子根霉(R.azygosporus)LT0229发酵生产天贝的制备工艺

1、孢子悬液制备

用接种铲从PDA平板上刮取新鲜的无接合孢子根霉LT0229的菌丝体到20mL液体培养基，30℃培养1天，将菌丝体转接入大瓶PDB液体培养基，30℃培养3-5天，离心收集菌体，生理盐水或无菌水清洗三次，重悬菌体制成1.0×10⁷CFU/mL的孢子悬液，用于固体发酵。

2、豆子预处理

2.1、浸泡：器具洗净，用沸水烫过后放凉。取精选大豆500克，洗净后加清水浸泡，用乳酸或者柠檬酸调节pH为4.5，浸泡约16小时，待豆子充分吸水。

2.2、去皮：将浸泡好的豆子手抓去掉豆皮，以得到脱皮的豆瓣；

2.3、水煮：将去皮的豆瓣放入清水中蒸煮15分钟至变软，蒸煮时间应控制得当，软度合适的豆瓣才能保证发酵菌株的快速繁殖，但又要有足够的强度使之在后续的加工过程中保持完整；

2.4、添加淀粉：将煮好的豆子捞出趁热拌入20克玉米淀粉，搅拌均匀；

2.5、沥水：将混匀的豆子倒入漏筐或帘子上沥水；

2.6、添加白醋：将白醋加入控干的豆子里，搅拌均匀；

2.7、发酵过程：加入前期准备的LT0229的孢子悬液，接种量为1％，搅拌均匀后装入5号塑封袋后置于30℃进行发酵，湿度设定在75～85％。发酵过程应注意控制好氧气含量。严格厌氧条件下的霉菌生长不良，甚至不生长，而氧气过多又会导致霉菌产生孢子影响产品感官。只有氧气平衡时霉菌才能形成紧密的乳白色状菌丝，并缚在豆子上形成一个坚硬的糕状物。因此，发酵过程需要在带有小孔的塑封袋中进行(每个小孔间隔大约1厘米)，这可以使霉菌生长良好而无孢子产生(虽然在袋子上的小孔处有时会发现微小的黑色区域)。由于薄膜的透明性，因此通过视觉观测就可以实现对霉菌生长的控制。35小时后发酵成熟，成品见图3所示。