一种壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶制备方法、一种含酚废水的降解方法与流程

本发明属于环境生物技术和工程领域，具体涉及一种壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶制备方法、一种含酚废水的降解方法。

背景技术：

漆酶是一类含铜多酚氧化酶，其利用分子氧为电子受体将其还原成水。漆酶的底物相当宽泛，能催化氧化水中多种难降解有机污染物，工业中的一个重要的应用是酚类的除去，此外还包括酚类衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、激素、生物色素和多环芳烃等。

漆酶的研究已经越来越引起环境微生物学学者的重视，但是仍存在一些问题，如催化效率低，使用成本过高等，阻碍了漆酶的在水处理工业界的广泛应用。

固定化酶是将游离酶用物理或化学方法处理，使之不溶于水，能在一定的空间范围内起酶催化作用，固定化酶与游离酶相比具有显著的优点：不仅能保持酶催化高效和专一性，而且能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性，可回收，易分离，能够重复使用，使用效率高，成本低等。固定化酶可以用于各种类型的反应器，特别在工业废水处理等方而的应用前景更为广阔。

固定化酶制备方法物理法包括吸附法、包埋法等，其优点在于酶不参加化学反应，整体结构完整，催化活性得到很好保留。目前使用的载体有：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔性玻璃、环氧乙烷丙烯酸颗粒和亲水性微滤膜、硅胶、多孔玻璃、介孔SiO₂、纳米材料等。

固定化酶制备化学法包括结合法、交联法等。结合法又分为离子结合法和共价结合法，是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。

含酚废水主要来自合成苯酚、合成染料、有机农药和酚醛树脂生产过程。主要污染物有酚基化合物，如苯酚、甲酚、二甲酚和硝基甲酚等。目前国内含酚废水的处理技术有物理法、化学法和生物法。其中物理法包括焚烧法、萃取法、蒸汽法、吸附法等；化学法有化学氧化法、高级氧化法(UV、Fenton)、化学沉淀法、离子交换法、液膜法等；生物法包括活性污泥法、生物滤池法、接触氧化法等。上述方法各有其优缺点，寻求稳定、可靠和安全含酚废水的处理方法仍是当前的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶制备方法，以具有微介双孔ZSM-5分子筛为载体，采用物理吸附固定化漆酶，以壳聚糖包裹固定化漆酶的ZSM-5分子筛，制作固定化小球，不易脱落，稳定性好。

本发明还提供了一种含酚废水的的降解方法，利用壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶，降解效率高。

本发明提供的一种壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶制备方法，包括以下步骤:

(1)改性ZSM-5沸石；

(2)将改性得到的ZSM-5分子筛与漆酶粗酶液混合，离心分离留沉淀，用缓冲溶液洗涤沉淀，得到Lac@ZSM-5；

(3)将壳聚糖CS与醋酸HAC溶液混合，得到CS/HAC胶体溶液；

(4)将CS/HAC胶体溶液与Lac@ZSM-5混合，得到浆状混合物；

(5)将浆状混合物逐滴加入到NaOH溶液中，得Lac@ZSM-5/CS小球，于pH为4.5的缓冲溶液中静置过夜，充分溶涨，用蒸馏水洗涤至中性，置于冰箱冷藏中低温干燥，得到壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶小球。

进一步的，步骤(1)改性方法为：将ZSM-5沸石，置于NaOH溶液中，搅拌，干燥后，过滤后洗涤，再干燥，得到具有微介双孔结构分布的改性ZSM-5分子筛。

进一步的，步骤(1)中ZSM-5沸石与NaOH溶液的用量比为1:50-80g/mL；所述ZSM-5沸石的硅铝比(SiO₂/Al₂O₃)＝18-30；相对结晶度：Na型>85％；孔径：NaOH溶液的浓度为0.3-0.5mol/L；所述搅拌为室温条件下搅拌20-40min；第一次干燥于50℃处理3-4h；过滤是指0.45um的过滤膜过滤；第二次干燥：110℃真空干燥箱中干燥10-12h。

步骤(2)中改性得到的ZSM-5分子筛与漆酶粗酶液的用量比为1:1g/mL；漆酶粗酶液的酶量为800-1000U/mL；混合条件为：25℃搅拌10-12h；所述缓冲溶液为pH为4.5的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液。

步骤(2)离心分离具体方法为：将ZSM-5分子筛与漆酶粗酶液混合后的溶液离心，离心机4000r/min、离心5-10min；

步骤(2)中确定产物的方法为：离心后，取上清液1mL加入1.0mmol/L的愈创木酚溶液中，至检测不到酶活(无紫外吸收)，即得到固定漆酶的Lac@ZSM-5样品。所述1mmol/L的愈创木酚溶液制备方法为：取愈创木酚0.061g，用1ml的乙醇进行溶解用缓冲溶液定容至500mL得到。

步骤(3)具体为：在25-50℃称取壳聚糖CS溶解于溶于0.1mol/L的醋酸溶液HAC中，搅拌2-3h后，得到CS/HAC胶体溶液；壳聚糖CS与醋酸溶液的用量比为1:80-120g/mL；所述壳聚糖脱乙酰度85％。

步骤(4)具体为：Lac@ZSM-5与CS/HAC胶体溶液的用量比为1：40-60g/ml。

步骤(4)中，CS/HAC胶体溶液与Lac@ZSM-5混合过程为，先在40-60KHz的超声波浴中30min；再在50r/min速度下搅拌30min制得浆状混合物。

步骤(5)中NaOH溶液浓度0.25mol/L；所述Lac@ZSM-5/CS小球直径1-2mm。

检测壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶(Lac@ZSM-5/CS)活性400-520U/g；Lac@ZSM-5/CS小球的酶学性质如下：最适pH值为4.5，在pH值为3.0-6.5间均能保持较高相对活性(59.5％-86.4％)，最适温度是55℃，温度为35-65℃时相对酶活约为77.5-89.2％，6批次后酶相对活性保留约42.3％；测得Lac@ZSM-5/CS小球的米氏常数K_m为2.182mmol/L(游离漆酶为2.054mmol/L)。

一种含酚废水的降解方法，包括以下步骤：

将Lac@ZSM-5/CS小球投入到含酚废水中，搅拌后，加入NaOH溶液将pH调至9.0-10.0，终止反应。

具体的，含酚废水浓度为40-60mg/L；Lac@ZSM-5/CS小球的堆积体积/废水的体积＝35-45％。所述搅拌是指25℃下搅拌反应2-3h。

所述含酚废水为含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚或2，4-二氯苯酚的废水。

所述NaOH溶液的浓度为0.1mol/L。

降解检测：

用苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、2，4-二氯苯酚四种物质配置浓度均为50mg/L的混合酚废水；向废水中投加Lac@ZSM-5/CS小球(小球的堆积体积/废水的体积＝35-45％)，在室温25℃下磁力搅拌反应2.5h，反应后的溶液用0.1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至9.0-10.0，终止反应；

过滤调节过后的溶液，用HPLC检测苯酚、邻苯二酚、间苯二酚和2,4-二氯苯酚的浓度，计算去除率。经过计算四种物质的降解率分别为36.8-40.2％、82.5-87.5％、30,7-33.2％和73.4-85.2％。

本发明以具有微介双孔ZSM-5分子筛为载体，采用物理吸附固定化漆酶，以壳聚糖包裹固定化漆酶的ZSM-5分子筛，制作固定化小球，解决了分子筛对漆酶吸附良好性能但对酶负载不稳固易脱落，壳聚糖具有良好的生物兼容性和适应性但是酶固定化面积小固定化效率低缺点。与现有技术相比，本发明提供的壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶特点为：(1)以ZSM-5分子筛作为骨架，可明显增强载体的力学强度；外包裹壳聚糖，可使酶不易从载体上渗出；分子筛比表面大，可极大地提升固定化漆酶容量，同时壳聚糖表面多孔疏松结构、介孔与微孔良好的相通性，不仅可缩短污染物和生成物在分子筛孔道中的扩散距离，而且能明显提高传质性能，强化污染物的降解速率；(2)固定化酶对强酸强碱环境的抵抗能力强，在pH值为3.0-6.5间均能保持较高相对活性(59.5％-86.4％)，温度为35-65℃时相对酶活约为77.5-89.2％，6批次后酶相对活性保留约42.3％，活力回收率高，表明Lac@ZSM-5/CS小球的具有较好的pH稳定性、热稳定性和一定的操作稳定性。；(3)固定化漆酶用于含混合酚废水的处理有明显的效果，对苯酚、邻苯二酚、间苯二酚和2,4-二氯苯酚的浓度具有较好的去除率，是一种可靠、安全含酚废水的处理新方法。

具体实施方式

实施例1

一种壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶制备方法，包括以下步骤:

(1)取5.0g商用ZSM-5沸石(硅铝比(SiO₂/Al₂O₃)＝18-30；相对结晶度：Na型>85％；孔径：)，置于250mL的0.4mol/L的NaOH溶液中，室温条件下搅拌40min；转入真空干燥箱，于50℃处理3h，过0.45um滤膜过滤，用去离子水洗涤，置于110℃真空干燥箱中干燥12h，得到改性ZSM-5分子筛；

(2)取5.0g改性ZSM-5分子筛与5mL 820U/mL的漆酶粗酶液于25℃搅拌10h，用离心机4000r/min、离心5min进行分离；用pH为4.5的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤沉淀，取上清液1mL加入1.0mmol/L的愈创木酚溶液中，至检测不到酶活，得到Lac@ZSM-5。

(3)在50℃称取2.5g壳聚糖(脱乙酰度85％)溶解于溶于200ml的0.1mol/L的醋酸溶液中，搅拌2h后，得到胶体溶液。

(4)往该溶液中加入5g Lac@ZSM-5，保持在频率为40KHZ的超声波浴中30min，继续高速搅拌30min制得浆状混合物。

(5)用针形注射器滴加该浆状混合物到0.25mol/L NaOH溶液中，得到直径约1mm的固定化漆酶小球，将小球加入100mL锥形瓶中,用缓冲液充分溶涨，静置过夜，用蒸馏水洗涤至中性，置于冰箱冷藏中低温干燥，然后于4℃下保存。进行酶学性质测定：最适pH值为4.5，最适温度是55℃，6批次后酶相对活性保留约45.3％。

用邻苯二酚、间苯二酚、2,4-二氯苯酚三种物质配置浓度均为40mg/L的混合含酚废水。向废水中投加固定化漆酶小球(小球的堆积体积/废水的体积＝40％)在室温25℃下磁力搅拌反应2.5h，反应后的溶液用0.1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至9.0，终止反应；过滤调节过后的溶液，将固定化漆酶小球滤出后，通过HPLC检测邻苯二酚、间苯二酚和2,4-二氯苯酚的浓度，经过计算三种物质的降解率分别为83.8％、32.2％和77.9％。

固定化漆酶载体酶活测定：取4mL、1mmol/L的愈创木酚于试管中，加入1g固定化漆酶，混合均匀后于30℃水浴反应30min，测定其在波长465nm下吸光度(OD₄₆₅)值。对照管中加入1g未固定化漆酶载体和4mL底物，酶活的计算公式如下式所示，定义1min内转化1umol底物所需的固定漆酶量为一个漆酶活力单位(U/g)：

其中式中：—(愈创木酚)＝1.21L/(mol/cm)；

Δt—为酶反应时间，min；

ΔOD—为吸光度的变化值；

V—为比色皿中溶液的总体积，mL；

m—为参加反应固定化漆酶的质量，g；

N—为酶液稀释倍数；

L—为比色皿光径，cm；

固定化酶载体酶学性质测定：

热稳定性：制备所得Lac@ZSM-5/CS小球置于30℃-70℃的水浴中保温90min，取样检测其酶活性；

pH稳定性：制备所得Lac@ZSM-5/CS小球，悬浮于不同pH的缓冲溶液中，室温条件下保存3小时，取样检测其酶活性。

操作稳定性：采用Lac@ZSM-5/CS小球与底物进行反应6-10次，取样检测其酶活性。

其中：为便于考察变量对酶活的影响，以同组实验中酶活最高值为100％进行数据处理。

K_m的值的计算：按Linewaever-Burk双倒数法，以底物浓度的倒数为为横坐标，以酶反应初速度的倒数为纵坐标作图，即反应后测定吸光度值A，以吸光度值的倒数1/A代表其反应速度的倒数1/V作为纵坐标(3min)，以底物的浓度倒数1/S为横坐标，作图以求出自由漆酶和固定化漆酶的K_m值。

$v=\frac{V\[S\]}{Km+\[S\]}$

其中，v-反应初速度(微摩尔浓度变化/min)；

V-最大反应速度(微摩尔浓度变化/min)；

[S]-底物浓度(mol/L)；

K_m-米氏常数(mol/L)。

HPLC分析条件：使用日本岛津：LC-20A HPLC系统，色谱柱：WondaSil C18-WR 4.6×250mm，5μm。检测器：SPD-M20A，分析条件：流动相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0-15min，55％；15-18min，55％；18-20min，30％)，等梯度洗脱流速1mL/min，柱温25℃，进样量10μL，检测波长277nm。

实施例2

一种壳聚糖/微介分子筛固定化漆酶制备方法，包括以下步骤:

(1)10.0g商用ZSM-5沸石(硅铝比(SiO₂/Al₂O₃)＝18-30；相对结晶度：Na型>85％；孔径：)，置于600mL的0.5mol/L的NaOH溶液中，室温条件下搅拌40min；转入真空干燥箱，于50℃处理4h，过0.45um滤膜过滤，用去离子水洗涤，置于110℃真空干燥箱中干燥12h，得到改性ZSM-5分子筛；

(2)取5.0g改性ZSM-5分子筛与10mL 930U/mL的漆酶粗酶液于25℃搅拌12h，用离心机4000r/min、离心7min进行分离；用pH为4.5的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液洗涤沉淀，取上清液1mL加入1.0mmol/L的愈创木酚溶液中，至检测不到酶活，得到固定漆酶的样品。

(3)在50℃称取5g壳聚糖(脱乙酰度85％)溶解于溶于400ml的0.1mol/L的醋酸溶液中，搅拌2h后，得到胶体溶液。

(4)往该溶液中加入10g上述固定化酶样品，保持在频率为40KHZ的超声波浴中约30min，继续高速搅拌30min制得浆状混合物。

(5)用针形注射器滴加该浆状混合物到0.25mol/L NaOH溶液中，得到直径约1mm的固定化漆酶小球，将小球加入100mL锥形瓶中,用缓冲液充分溶涨，静置过夜，用蒸馏水洗涤至中性，置于冰箱冷藏中低温干燥，然后于4℃下保存。

进行酶学性质测定：最适pH值为4.5，最适温度是55℃，6批次后酶相对活性保留约47.7％；用苯酚、间苯二酚、2,4-二氯苯酚三种物质配置浓度均为50mg/L的混合含酚废水。向废水中投加固定化漆酶小球(小球的堆积体积/废水的体积＝35％)，在室温25℃下磁力搅拌反应2.5h，反应后的溶液用0.1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至9.0，终止反应；过滤调节过后的溶液，将固定化漆酶小球滤出后，通过HPLC检测邻苯二酚、间苯二酚和2,4-二氯苯酚的浓度，经过计算三种物质的降解率分别为38.3％、86.2％和83.1％。