一种双网络高强度丝蛋白水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于天然高分子材料技术领域，具体涉及一种双网络高强度天然生物大分子水凝胶及其制备方法。

背景技术：

随着组织工程领域的发展，对于性能优异且适合于生物友好环境中使用的生物医用材料及其制备技术的需求日益高涨。水凝胶是富含大量水分子的交联网络，有较强的通透性，且与细胞外基质在结构和功能上相似，因此水凝胶既是一类重要的可用于重建组织工程细胞支架的材料，又是一类极具前景的药物缓释类载体材料。

蚕丝蛋白作为一种天然高分子材料，其来源丰富，同时具备优良的力学性能、可控的降解性能及良好的生物相容性，因而在生物医用领域具有广泛的应用前景。但与此同时，对于利用再生丝蛋白溶液制备的水凝胶材料，通常由于其力学性能较差而限制了其在某些组织工程领域中实际应用，例如需承重较大压力的软骨或韧带等修复材料。为了解决这个问题，有研究报道用辣根过氧化物酶化学交联得到丝蛋白水凝胶，但其储能模量通常只有0.1-10 KPa (CN 104017374 A)， 而且该水凝胶结构不稳定，在37^oC条件下长时间放置会出现凝胶至溶液的转变。在制备高强度丝蛋白水凝胶的研究中，有研究报道利用表面活性剂的特性制备高强度的丝蛋白水凝胶(丝蛋白/水: 15/85 (w/w))，其压缩模量和拉伸模量达到3.0 MPa，但是丝蛋白在低浓度时所制备的水凝胶不具备良好的力学性能，而且表面活性剂会有一定细胞毒性；也有研究报道利用丝蛋白与纤维素衍生物制备高强度复合水凝胶 (CN 104845382 A)，其同样对丝蛋白的浓度有一定限制。

本发明通过辣根过氧化物酶化学交联丝蛋白得到化学交联网络，然后将其置于可诱导丝蛋白发生β 折叠转变的溶液中形成物理交联网络，得到一类模量高、韧性强且具有很好的生物相容性的双网络高强度丝蛋白水凝胶，此类水凝胶凝胶的固含量可在2-20 wt%之间调整来控制其相应力学性能。除此之外，其制备方法简单，重复性好，并且细胞可在其表面铺展生长。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有可调良好力学性能以及良好稳定性的双网络高强度丝蛋白水凝胶及其制备方法。

本发明提供的双网络高强度丝蛋白水凝胶，以质量分数分别为2-20 wt%的丝蛋白水溶液经辣根过氧化物酶化学交联形成丝蛋白水凝胶，然后将其浸泡于能诱导丝蛋白β 折叠转变的溶液中形成物理交联，即得双网络高强度丝蛋白水凝胶。所述能诱导β 折叠的水溶液为含有机溶剂类、表面活性剂类、或酸性溶液的任何一种。

本发明提供的双网络高强度丝蛋白水凝胶的制备方法，具体步骤为：

（1）制备丝蛋白水溶液，使其最终浓度为2-20 wt%；

（2）在步骤（1）所得丝蛋白溶液中加入辣根过氧化物酶（0.01-1 mg/mL）和过氧化氢（0.01-1% v/v）溶液，溶剂为水，25-50℃下进行化学交联，得到丝蛋白凝胶网络；

（3）将步骤（2）所得丝蛋白凝胶网络浸泡于能诱导丝蛋白β 折叠转变的溶液中，浸泡时间为6-48 h，即得双网络高强度丝蛋白水凝胶。

本发明中，所述的丝蛋白为桑蚕或柞蚕丝蛋白的一种或两者混合。

本发明中，所述的辣根过氧化物酶与过氧化氢的质量比范围宜为10:1-1:1。

本发明中，所述的能诱导β 折叠的溶液为含有机溶剂类、表面活性剂类、或酸性溶液中的任何一种，或其中几种的混合。

本发明中，所述的有机溶剂类为(但不仅限于)甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、吡啶、丙酮、氯仿中的任何一种，或其中几种的混合, 浓度为50-95% v/v。

本发明中，所述表面活性剂类为(但不仅限于)十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚中的任何一种，浓度为5-40 mM。

本发明中，所述酸性溶液为能将溶液pH降低至2-5的任何一种，浓度为0.05-5% w/w。

本发明中，步骤（1）中所述丝蛋白水溶液可为纯丝蛋白溶液，也可为还含其他成分的混合溶液/悬浊液，其他成分包括水溶性高分子、功能性无机材料或药物分子等。

本发明方法也可用于制备高强度丝蛋白膜及丝蛋白支架材料。

本发明制备的双网络高强度丝蛋白水凝胶，可用于生物医学工程及纳米功能材料领域。

采用本发明方法制备双网络高强度丝蛋白水凝胶，具有以下优点：

（1）本发明所述的水凝胶原料为成本低廉且经过美国食品药品监督管理局认证的丝蛋白，以此所得水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性；

（2）本发明采用的辣根过氧化物酶主要提取于山葵植物根部，已实现商业化生产；过氧化物为外科手术中常用的低浓度的过氧化氢，且有实验证明采用辣根过氧化物酶交联的丝蛋白水凝胶无细胞毒性；

（3）本发明采用的能诱导丝蛋白β 折叠转变的溶液，及酶催化反应的残留都可通过与去离子水置换除去；

（4）本发明制备的双网络高强度水凝胶由化学交联网络与物理交联网络共同组成，性能优于由单独由辣根过氧化物酶化学交联的丝蛋白水凝胶，且该水凝胶在模拟体内环境条件下性能稳定；

（5）本发明对于低浓度的丝蛋白（如2-5 wt%）仍可以制备力学良好性能的水凝胶，区别于已报道的高强度丝蛋白水凝胶制备方法对丝蛋白浓度的限制；

（6）本发明所述的丝蛋白溶液，可为水溶性高分子，功能性无机纳米粒子，药物分子等的混合溶液，可制备具有多功能性的高强度水凝胶；

（7）此外，本发明制备条件简单高效，绿色环保，重复性好，具有推广应用的价值。

附图说明

图1为双网络高强度丝蛋白水凝胶(4 wt%)的弯曲形变示意图。

图2为NaHCO₃脱胶的丝蛋白(10 wt%)水凝胶的拉伸与压缩的力学性能曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，以进一步阐述本发明。有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

实施例 1

取质量分数为10 wt%的桑蚕丝蛋白溶液2 mL，加入40 μL，0.5mg/mL的辣根过氧化物酶，均匀混合后加入40 μL，0.05%过氧化氢水溶液，37 ℃形成凝胶网络；然后将其置于75%乙醇溶液中浸泡24 h，得到高强度的丝蛋白水凝胶，压缩模量达到1.37 MPa，拉伸模量3.35 MPa。测试表明，在模拟体内环境条件下性能稳定，细胞相容性好。

实施例 2

取质量分数为2 wt%的柞蚕丝蛋白溶液4 mL，加入80 μL，1 mg/mL的辣根过氧化物酶，均匀混合后加入80 μL，0.2%过氧化氢水溶液，40 ℃形成凝胶网络；然后将其置于70%异丙醇溶液中浸泡12 h，得到高强度的丝蛋白水凝胶，压缩模量达到0.28 MPa，拉伸模量0.2 MPa。测试表明，在模拟体内环境条件下性能稳定，细胞相容性好。

实施例 3

取质量分数为20 wt%的柞蚕丝蛋白溶液2 mL，加入40 μL，0.1 mg/mL的辣根过氧化物酶，均匀混合后加入40 μL，0.01%过氧化氢水溶液，25 ℃形成凝胶网络；然后将其置于0.5M十二烷基硫酸钠溶液中浸泡48 h，得到良好力学性能的丝蛋白水凝胶，压缩模量达到3.2 MPa，拉伸模量3.5 MPa。测试表明，在模拟体内环境条件下性能稳定，细胞相容性好。

实施例 4

取质量分数为10 wt%的桑蚕丝蛋白溶液2 mL，加入40 μL，0.8 mg/mL的辣根过氧化物酶，均匀混合后加入40 μL，0.2%过氧化氢水溶液，37 ℃形成凝胶网络；然后将其置于pH为2.5的醋酸水溶液中浸泡24 h，得到高强度的丝蛋白水凝胶，压缩模量达到1.0 MPa，拉伸模量2.1 MPa。测试表明，在模拟体内环境条件下性能稳定，细胞相容性好。

实施例 5

取质量分数为8 wt%的柞蚕丝蛋白与8 wt%明胶的混合溶液5 mL，加入100 μL，0.5 mg/mL的辣根过氧化物酶，均匀混合后加入100 μL，1 %过氧化氢水溶液，25 ℃形成凝胶网络；然后将其置于0.1M十二烷基磺酸钠溶液中浸泡10 h，得到高强度的丝蛋白水凝胶，压缩模量达到1.25 MPa，拉伸模量2.0 MPa。测试表明，在模拟体内环境条件下性能稳定，细胞相容性好。

实施例 6

取质量分数为12 wt%的桑蚕丝蛋白与2 wt%氧化石墨烯的混合溶液2 mL，加入40 μL，0.2 mg/mL的辣根过氧化物酶，均匀混合后加入40 μL，0.05%过氧化氢水溶液，37 ℃形成凝胶网络；然后将其置于75%正丁醇溶液中浸泡24 h，得到高强度的功能化丝蛋白水凝胶，压缩模量达到2.52 MPa，拉伸模量2.35 MPa。测试表明，在模拟体内环境条件下性能稳定，细胞相容性好。

实施例 7

取质量分数为4 wt%的桑蚕丝蛋白溶液5 mL，加入50 μL，1 mg/mL的辣根过氧化物酶，均匀混合后加入50 μL，0.3%过氧化氢水溶液，将混合溶液倒入10cm*10cm模具中，成膜室经过24小时成膜；然后将其置于75%乙醇溶液中浸泡24 h，得到高强度的丝蛋白膜，湿态下拉伸模量103Mpa，拉伸应变300%。测试表明，在模拟体内环境条件下性能稳定，细胞相容性好。