本发明涉及农业微生物技术领域，特别涉及一种副鸡嗜血杆菌B型株发酵培养基。
背景技术：
副鸡嗜血杆菌作为鸡传染性鼻炎的致病菌，可以导致鸡上呼吸道感染，该病爆发时可引起蛋鸡产蛋量下降，孕成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，给养鸡业造成较大的损失等。
按照Page的分型方法，副鸡嗜血杆菌可分为A、B、C三个血清型，各型之间不产生交叉保护。根据流行病学调查发现，目前B型菌株流行性较广。
目前文献中关于A型的研究报道较多，并取得一定成果，但是关于B型的研究报道很少，关于B型菌株发酵的几乎没有相关报道。
此外，副鸡嗜血杆菌对营养要求较为苛刻，在普通培养基上基本不生长，绝大部分分离株需要在培养基中添加还原型NAD。采用商业化的TSB培养基进行培养过程中发现，菌体适应期长，生长缓慢，且成本较高，不适合B型菌株的生长。
因此，寻求一种新型的培养基以适应B型菌株的生长代谢，成为B型菌株工业化生产过程中首先需要解决的问题。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种副鸡嗜血杆菌B型株发酵培养基。
本发明的技术方案为：
一种副鸡嗜血杆菌B型株发酵培养基，包括：5-100g/L的酪蛋白胨、0.5-80g/L的酵母粉、0.5-80g/L的多价胨、0.5-20g/L的氯化钠、0.5-20g/L的谷氨酸钠、0.5-30g/L的葡萄糖、0.5-30g/L的鱼粉蛋白胨、5-100mL/L的鸡血凊、0.5-50mL/L的微量元素溶液、1-30mL/L的NAD溶液。
本发明的培养基具有以下特点：含有副鸡嗜血杆菌B型菌株生长所必需的营养成分。
其中，选择葡萄糖作为碳源，葡萄糖作为速效碳源，能迅速被B型菌株吸收利用，为菌体生长提供能量，但是葡萄糖浓度过高时，会导致呼吸加快，菌体内部乙酸大量积累，影响酶的活性，不利于菌体的生长。
酪蛋白胨、多价胨、酵母粉、鱼粉蛋白胨作为复合氮源，营养丰富，且易于菌体吸收，利于菌体生长，特别是鱼粉蛋白胨和酵母粉，含有部分前体类物质及微量元素等，可以有效的促进副鸡嗜血杆菌B型菌株的生长。
鸡血清中部分蛋白、多肽及V因子等，可被菌体直接吸收利用，明显的缩短菌体的适应期，缩短发酵周期。微量元素中的几种无机盐离子，不仅可以维持正常渗透压，进入菌体内部后还可以作为酶的激活剂，激活酶活，调节菌体的生长代谢。
作为优选方案，所述副鸡嗜血杆菌B型株发酵培养基，包括8-50g/L的酪蛋白胨、1-50g/L的酵母粉、1-50g/L的多价胨、1-15g/L的氯化钠、1-15g/L的谷氨酸钠、1-20g/L的葡萄糖、1-20g/L的鱼粉蛋白胨、8-60mL/L的鸡血凊、1-30mL/L的微量元素溶液、3-20mL/L的NAD溶液。
作为优选方案，所述副鸡嗜血杆菌B型株发酵培养基，包括10-30g/L的酪蛋白胨、2-10g/L的酵母粉、2-10g/L的多价胨、2-10g/L的氯化钠、2-10g/L的谷氨酸钠、2-10g/L的葡萄糖、2-10g/L的鱼粉蛋白胨、10-50mL/L的鸡血凊、2-20mL/L的微量元素溶液、5-10mL/L的NAD溶液。
作为优选方案，所述微量元素溶液为包括亚铁离子、镁离子、锌离子、钙离子的盐酸水溶液。
进一步地，所述微量元素溶液为1-3g/L七水合硫酸亚铁、1.2-2.5g/L氯化镁、1-2g/L七水合硫酸锌、1.5-2.8g/L氯化钙、15-20g/L氯化氢的混合水溶液。
作为优选方案，NAD溶液的浓度为0.5-1.5g/L。
所述副鸡嗜血杆菌B型株发酵培养基的制备方法，包括步骤：
1）称取酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、氯化钠、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨以及微量元素溶液，加入蒸馏水溶解，定容后，升温至35-38℃，用8-12M的氢氧化钠溶液调节pH为7.2-7.4，灭菌；
2）制备400-600g/L的葡萄糖水溶液，灭菌；
3）制备0.5-1.5g/L的NAD水溶液，灭菌；
4）将步骤2）、步骤3）所得无菌液体在无菌条件下加入步骤1）所得无菌溶液，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
所述副鸡嗜血杆菌B型株发酵培养基在培养副鸡嗜血杆菌B型株中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明培养基中含有副鸡嗜血杆菌B型菌株生长所必须的各种营养成分，利于菌株的生长代谢，缩短菌体适应期，接种后菌体适应能力强，发酵周期短，收获时含菌量高（收获时，活菌数高达70亿）。
本发明提供了一种可用于疫苗行业大规模生长的副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基，其原材料易得，价格低廉，且能满足疫苗生产的GMP规定，可实现规模化生产。采用该培养基进行B性菌株的培养，可满足疫苗行业大规模生产的需要，有广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 30g，酵母粉10g，多价胨10g，氯化钠10g，谷氨酸钠10g，鱼粉蛋白胨8g，葡萄糖20g，微量元素溶液10mL，鸡血清30 mL，辅酶（NAD溶液）10 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
其中，微量元素溶液为2g七水合硫酸亚铁、1.8g氯化镁、1.4g七水合硫酸锌、2.1g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为1.0g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将40mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同10 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为73亿。
实施例2
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 15g，酵母粉8g，多价胨8g，氯化钠10g，谷氨酸钠10g，鱼粉蛋白胨5g，葡萄糖15g，微量元素溶液50mL，鸡血清30mL，辅酶（NAD溶液）10mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.4。
其中，微量元素溶液为2g七水合硫酸亚铁、1.8g氯化镁、1.4g七水合硫酸锌、2.1g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为1.0g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.4，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将30mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同10 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为70亿。
实施例3
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 15g，酵母粉5g，多价胨5g，氯化钠10g，谷氨酸钠10g，鱼粉蛋白胨5g，葡萄糖15g，微量元素溶液5ml，鸡血清30mL，辅酶（NAD溶液）5mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.2。
其中，微量元素溶液为2g七水合硫酸亚铁、1.8g氯化镁、1.4g七水合硫酸锌、2.1g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为1.0g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.4，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将30mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同5 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为77亿。
实施例4
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 10g，酵母粉5g，多价胨20g，氯化钠5g，谷氨酸钠15g，鱼粉蛋白胨15g，葡萄糖15g，微量元素溶液15mL，鸡血清20 mL，辅酶（NAD溶液）5 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
其中，微量元素溶液为1g七水合硫酸亚铁、2.3g氯化镁、1.6g七水合硫酸锌、1.6g氯化钙、40g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为1.3g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取600g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1.3gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将25mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同5 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及20 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为72亿。
实施例5
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 50g，酵母粉20g，多价胨5g，氯化钠8g，谷氨酸钠8g，鱼粉蛋白胨12g，葡萄糖10g，微量元素溶液20mL，鸡血清40 mL，辅酶（NAD溶液）15 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
其中，微量元素溶液为2.5g七水合硫酸亚铁、1.5g氯化镁、1.8g七水合硫酸锌、1.8g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为0.8g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取400g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取0.8gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将25mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同15 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及40 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为71亿。
对比例1
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 30g，酵母粉10g，多价胨10g，氯化钠10g，谷氨酸钠10g，鱼粉蛋白胨8g，葡萄糖20g，鸡血清30 mL，辅酶（NAD溶液）10 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
辅酶（NAD溶液）的浓度为1.0g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将40mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同10 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为31亿。
对比例1与实施例1的区别仅在于，不包括微量元素溶液。
对比例2
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 30g，酵母粉10g，多价胨10g，氯化钠10g，谷氨酸钠10g，鱼粉蛋白胨8g，葡萄糖20g，微量元素溶液10mL，鸡血清30 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
其中，微量元素溶液为2g七水合硫酸亚铁、1.8g氯化镁、1.4g七水合硫酸锌、2.1g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）将40mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为43亿。
对比例2与实施例1的区别仅在于不包括NAD溶液。
对比例3
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 30g，酵母粉10g，多价胨10g，氯化钠10g，鱼粉蛋白胨8g，葡萄糖20g，微量元素溶液10mL，鸡血清30 mL，辅酶（NAD溶液）10 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
其中，微量元素溶液为2g七水合硫酸亚铁、1.8g氯化镁、1.4g七水合硫酸锌、2.1g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为1.0g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将40mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同10 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为57亿。
对比例3与实施例1的区别仅在于不包括谷氨酸钠。
对比例4
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 30g，酵母粉10g，多价胨10g，氯化钠10g，谷氨酸钠10g，鱼粉蛋白胨8g，葡萄糖60g，微量元素溶液10mL，鸡血清30 mL，辅酶（NAD溶液）10 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
其中，微量元素溶液为2g七水合硫酸亚铁、1.8g氯化镁、1.4g七水合硫酸锌、2.1g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为1.0g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g葡萄糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将120mL步骤2）中的葡萄糖溶液连同10 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为51亿。
对比例4与实施例1的区别仅在于，葡萄糖浓度增大。
对比例5
培养基配方组分及配比：
酪蛋白胨 30g，酵母粉10g，多价胨10g，氯化钠10g，谷氨酸钠10g，鱼粉蛋白胨8g，蔗糖20g，微量元素溶液10mL，鸡血清30 mL，辅酶（NAD溶液）10 mL，水，10M氢氧化钠溶液调节pH7.3。
其中，微量元素溶液为2g七水合硫酸亚铁、1.8g氯化镁、1.4g七水合硫酸锌、2.1g氯化钙、50g的36%的浓盐酸，定容至1L所得溶液。辅酶（NAD溶液）的浓度为1.0g/L。
培养基经下列方法制得：
1）将酪蛋白胨、酵母粉、多价胨、NaCl、谷氨酸钠、鱼粉蛋白胨溶解后，加入微量元素溶液，加水，定容至1000mL，升温至37℃，调节pH至7.3，121℃下高压蒸汽灭菌20min。
2）称取500g蔗糖，定容至1000ml，115℃高压蒸汽灭菌30min；
3）称取1gNAD，定容至1000ml，采用0.22um滤膜进行过滤除菌；
4）将40mL步骤2）中的蔗糖溶液连同10 mL步骤3）中过滤除菌的辅酶溶液以及30 mL鸡血清一起加入到步骤1）中的无菌溶液中，即得副鸡嗜血杆菌B型菌株高密度发酵培养基。
灭菌后的培养基按3%接种量，37.5℃条件下进行发酵，4.5h取样计数，活菌数为57亿。
对比例5与实施例1的区别仅在于将碳源由葡萄糖换为蔗糖。