本发明涉及病毒培养
技术领域：
，具体涉及一种扩增柯萨奇病毒A16型的优化工艺方法。
背景技术：
：柯萨奇病毒A16型(CVA16)是手足口病的主要病原体之一，目前发现由CVA16感染引起的手足口病也可以引起较为严重的并发症，因此研发CVA16病毒相关疫苗有一定必要性。目前绿猴肾(Vero)细胞的大规模培养技术相对比较成熟，但在培养CVA16病毒方面报导较少，目前有用Cytodex1作为载体培养CVA16取得一定进展，但在片状纤维(Fibradisk)载体上尚未报导。要建立并完善这个培养病毒工艺首先要对VERO细胞生理和生长特性的有全面的认识和掌握，对CVA16感染细胞后的复制机理有比较深入细致的把握。细胞感染病毒后会发生各种变化，细胞干重、蛋白和核酸(DNA)含量、细胞大小等都有不同程度的增加，而Vero在不含血清的培养基中感染病毒后直径扩大20％左右，24，48小时后细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量一般会增加30％-100％,氧气(O2)消耗和三磷酸腺苷(ATP)的生成同样会大幅度增高，细胞在感染的过程需要更多的能量，需要注意营养物质(葡萄糖、氨基酸等)的适度补给。病毒的产量跟细胞密度并不始终成正比，根据“细胞密度效应”，当细胞密度在某个培养系统下大于某个数值，病毒产量不再增加反而有下降趋势，其原因可能与单位体积内营养物质的争夺和代理产物毒性有关。在CVA16扩增的过程中，之前的工艺摸索发现细胞密度在超过5×106个/ml后，病毒滴度将不再有明显成比例增长，甚至在高密度下有下降趋势。通常CVA16的复制的最短周期大概在20小时左右，初始接种病毒细胞数比值即感染复数(MOI)一般在1.0以下,实际上大部分细胞尚未被感染，病毒可以通过细胞连接或释放到细胞外，再次吸附两种方式再次感染细胞，在无血清培养基下让病毒继续吸附感染正常细胞将最终有利于病毒总体滴度的提高。由于在病毒培养阶段最好用不带有任何血清的培养基，因此探索一种较为廉价的无血清培养基非常关键。水解乳蛋白是一种安全有效的培养基添加剂，已有广泛的使用，在扩增CVA16病毒的工艺中目前尚无报导使用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种扩增CVA16的优化工艺方法，通过多层次优化CVA16的扩增工艺，以获得更高滴度的CVA16，稳定该工艺且达到重复性好和稳定性高的特点，并最终能适用于CVA16灭活病毒疫苗的生产。本发明以片状纤维为载体，用生物反应器扩增Vero细胞，建立CVA16复制扩增的全套工艺流程。本方法建立在对CVA16复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含8v/v％的血清的DMEM培养基，培养细胞第5-6天换液成无血清DMEM培养基，吸附CVA162-3小时，加入3-5v/v％胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清DMEM培养基加0.5w/v％水解乳蛋白，静止再吸附3小时利于更多细胞均匀感染病毒，继续培养，同时每24小时左右添加2g/L的葡萄糖,采用换液收获的方式。该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，使优化工艺达到较高的病毒滴度。本发明扩增CVA16的优化工艺方法，具有如下步骤：1)在生物反应器内加入含8v/v％的血清的DMEM培养基，接种VERO细胞，换液培养5-6天，密度达到5×106个/ml以上；换液成无血清DMEM培养基，接种CVA16，33℃静止吸附2-3小时，加入3-5v/v％胎牛血清连续培养扩增病毒20小时；弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，换成无血清DMEM培养基添加0.5w/v％水解乳蛋白，静止再吸附病毒3小时，继续培养，每24小时左右换液收获；(2)72-96小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1.5g/L，共收获上清15-20L；(3)用膜包(milliporePelliconXL)浓缩20-50倍，用于进一步纯化。进一步地，生物反应器所用片状纤维载体为150克。进一步地，柯萨奇病毒A16型接种量即感染复数MOI为0.5，即病毒TCID50值和细胞数比值。进一步地，病毒收获方式采用批式收获或连续灌注收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为24、48、72和96小时，以换成无血清DMEM培养基添加0.5％水解乳蛋白静止再吸附病毒3小时后开始计。具体根据细胞状态和葡萄糖消耗情况决定换液频率和体积。进一步地，生物反应器设定参数：(1)细胞培养阶段pH7.1-7.5、温度37℃、溶氧50-80％、搅拌速度40-55rpm；(2)接毒后，pH7.2-7.4、温度33℃、溶氧50-70％、搅拌速度30-45rpm。本发明的有益效果：本发明方法用片状纤维载体，在生物反应器中扩增Vero细胞，并建立CVA16复制扩增的全套工艺流程。本发明在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，对CVA16复制扩增体系多个参数进行优化，尽可能达到了最大收获滴度，该方法同时具有很高的重复性和稳定性，高效CVA16扩增工艺，可适用于任何以Fibradisk为载体的生物反应器扩增CVA16。在一定规模下生产CVA16疫苗具有很好性价比和应用前景，为节约人力物力成本打下基础。附图说明图1安普AP20sc反应器葡萄糖消耗和CVA16病毒TCID50曲线。图2NBSBioflo310反应器葡萄糖消耗和CVA16病毒TCID50曲线。具体实施方式为使本发明更加容易理解，以下用具体实施例来解释说明本发明。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不是对本发明进行限制。以下实施例涉及到的细胞为可以扩增CVA16病毒的细胞，优选Vero细胞，购自美国ATCC。细胞生长液为含8v/v％血清的DMEM培养基(美国GIbco公司)。细胞维持液为含0.5w/v％水解乳蛋白的DMEM培养基(美国Gibco公司)。生长液葡萄糖含量测定方法：葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法)，上海荣盛生物药业有限公司；将标明R1和R2的试剂等量混合各1ml，加入20ul样品，37℃水浴13min，显色后，在波长505nm处读取吸光值；葡萄糖(mmol/L)＝样本吸光度(A)/校准吸光度(A)×校准液浓度；葡萄糖(g/L)＝mmol/L×18；糖耗(g/L)＝原培养基葡萄糖含量(g/L)-培养24小时后葡萄糖含量(g/L)。CVA16病毒滴度测定：1.常规通用TCID法(Reed-Muench法)，病毒样品以10倍稀释度接种于96孔细胞培养板，96小时候通过显微镜下细胞病变效应(CPE)产生的噬斑计算病毒TCID50感染性滴度。细胞工厂培养种子细胞和病毒：种子细胞培养：细胞复苏后，在细胞培养瓶(美国Corning公司，)进行传代，每3天按1:3传，直至40瓶150ml培养瓶消化共得到8×108个细胞，接种到10层细胞工厂(美国Corning公司)，底面积为640平方厘米，三天后消化得到2.2×109个细胞左右。病毒种子培养：从最初构建后在25平方厘米(cm2)方瓶培养得到约为5.0LogTCID50/ml感染滴度的病毒，每次接种量即感染复数MOI在1.0以下，然后从75cm2扩增至150cm2，最后到细胞工厂(底面积640cm2)，得到种子病毒滴度大于7.0LogTCID50/ml。实施例1生物反应器：杭州安普生物工程有限公司10L激流式生物反应器，工作体积为8L，型号：AP20sc；微载体：Fibradisk纸片载体150克(杭州安普生物工程有限公司)；病毒：柯萨奇病毒CVA16型，浙江株，B1亚型；接种MOI值约为0.5；生物反应器细胞培养：10L反应器内已加入灭菌后的150gFibradisk载体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS浸泡过夜，弃去后加入8L细胞生长液，接种VERO细胞，接种量为(2.1±0.3)×109个细胞，进行培养。培养参数设定为：pH7.1-7.5、温度37℃、溶氧50-80％、搅拌速度40-55转/分(rpm)。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况，从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用批式换液，分别在48小时换液4L，96小时换液5L，120小时换液4L，144小时细胞计数在(2.8±0.4)×1010个细胞，密度达到7×106个/ml以上。具体工艺流程参数见表1，葡萄糖消耗情况见图1。病毒收获：144小时换液成无血清DMEM培养基8L，在无血清条件下吸附病毒3小时，然后加入5v/v％的胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，换液成无血清DMEM培养基添加0.5w/v％水解乳蛋白，静止让新释放的病毒继续吸附未感染细胞3小时，继续培养。收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为24、48、72和96小时，以换成无血清DMEM培养基添加0.5％水解乳蛋白静止再吸附病毒3小时后开始计，各收获5L，共收获上清20L。培养参数设定：pH7.2、温度33℃、溶氧50-70％、搅拌速度40-45rpm。上清用于浓缩、纯化：用膜包浓缩20-50倍，用于进一步纯化。病毒滴度测定结果见表2和图1。表1.安普AP20SC生物反应器工艺流程表表2.各批次AP20sc反应器CVA16病毒滴度批次1234LogTCID50/ml7.457.607.707.5实施例2生物反应器：NBS5L细胞反应器，型号：Bioflo310(美国NBS公司)，工作体积为4L；微载体：Fibradisk纸片载体150克(美国NBS公司)；病毒：柯萨奇病毒A16型(CVA16)C4亚型(浙江株)；接种感染性复数MOI约为0.5；细胞培养：5L反应器内已加入灭菌后的150gFibradisk载体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS浸泡过夜，弃去后加入细胞生长液4L为一个工作体积，接种VERO细胞，接种量为2.3×109个细胞，进行培养。培养参数设定为：PH7.1-7.5、温度37℃、溶氧50-80％、搅拌速度40-50rpm。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况，从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用连续灌流，24-48小时灌注换液3L，48-72小时灌注换液3L,72-96小时灌注换液4L，96-120小时灌注换液4L，120-144小时灌注换液5L，144小时细胞计数在(2.6±0.4)×1010个细胞，密度达到6×106个/ml以上。具体工艺流程参数见表3，葡萄糖消耗情况见图2。病毒收获：144小时换液成无血清DMEM培养基4L，在无血清条件下吸附病毒3小时，然后加入5v/v％的胎牛血清，继续培养20小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，换液成无血清DMEM培养基添加0.5w/v％水解乳蛋白，静止再吸附3小时，继续培养。收获方式采用连续收获，从换成无血清DMEM培养基添加0.5％水解乳蛋白静止再吸附病毒3小时后开始连续灌注，每24小时灌注收获5L，至96小时共收获上清20L。培养参数设定：pH7.2-7.3、温度33℃、溶氧50-70％、搅拌速度40rpm。上清用于浓缩、纯化：用膜包浓缩20-50倍，用于进一步纯化。病毒滴度测定结果见表4和图2。表3.NBS(Bioflo310)生物反应器工艺流程表表4.各批次Bioflo310反应器CVA16病毒滴度批次1234LogTCID50/ml7.507.457.657.60当前第1页1 2 3