本发明涉及一种FISH探针的制备方法。
背景技术：
：FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。FISH使用的探针序列来源于基因组或BAC(细菌人工染色体)DNA，包含许多重复序列。串联重复序列(Tandemrepeat)，如存在于着丝粒的α卫星DNA(SatelliteDNA)；散在重复序列(Interspersedrepeat)，如Alu家族。探针中的这些重复序列，在与基因组杂交时易产生非特异信号，如何去除成为探针制备过程中的难题。人类Cot-1DNA是在杂交中常用来封闭及去除重复序列的工具之一。探针制备前，可以使用人类Cot-1DNA筛选出重复序列，得到特异性模板再制备探针。然而，人类Cot-1DNA只包含目的片段中重复序列的一部分，因此，采用Cot-1DNA并不能有效去除非特异性信号。技术实现要素：本发明提供了一种FISH探针的制备方法，其克服了
背景技术：
中FISH探针的制备方法所存在的不足。本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：一种FISH探针的制备方法，它包括如下步骤：1)在探针制备前，对目的片段进行重复性序列分析，并据此合成目的片段序列中比例较高的特异性重复序列；2)选择下面方案中的一种制备探针：将合成的特异性重复序列和人类Cot-1DNA同时筛选去除重复序列，得到特异性模板或探针；或，利用合成的特异性重复序列去除对应的重复序列后制备探针，再使用人类Cot-1DNA进行封闭；或，利用人类Cot-1DNA筛选去除对应的重复序列后制备探针，再使用合成的特异性重复序列进行封闭；或，探针制备后使用合成的特异性重复序列和人类Cot-1DNA同时进行封闭。筛选重复序列的方法，包括生物素偶联的人类Cot-1DNA和/或生物素偶联的特异性重复序列通过亲和层析去除目的片段的重复序列；或是人类Cot-1DNA和/或特异性重复序列与目的片段中的重复序列优先复性结合成双链，用双链特异性核酸酶切除重复序列。在优选的实施例中，步骤1)使用Genomicinformationresearchinstitute(基因信息研究所)或instituteforsystemsbiology(系统生物学研究所)在线序列分析软件RepeatMasker对目的片段进行重复性序列分析。在步骤1)合成序列中比例较高的特异性重复序列中，术语“重复序列”如
背景技术：
所述，包括串联重复序列(Tandemrepeat)，如存在于着丝粒的α卫星DNA(SatelliteDNA)；散在重复序列(Interspersedrepeat)，如Alu家族。术语“比例较高”的定义为序列中重复次数大于10或序列长度占比超过5％。所述的合成可以采用现有技术。采用本发明的方法，可以大大提高探针的特异性,背景噪音少，信噪比好。附图说明下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1为本发明的流程示意图。图2为实施例2的FISH探针检测结果图；上行三个图为一个样本，下行三个图为另一个样本。图3为传统方法(cot-1封闭)制备的探针与实施例2制备的探针在细胞上的杂交效果对比。具体实施方式实施例1以HER-2基因为例，使用Genomicinformationresearchinstitute(Giri)在线序列分析软件RepeatMasking对目的片段进行重复性序列分析，并据此合成目的片段序列中比例较高的特异性重复序列。1、在Giri网站上点击RepeatMasking，输入目的片段序列，选择物种类型和分析类型后，提交分析。2、分析结果分5部分，第一部分是“MapofHits”，罗列了所有比对到的重复序列名称、类型及比对到目的片段上的位置信息，第二部分是“Maskedsequence”，将比对到的重复序列隐藏，只显示特异的目标序列，第三部分是“Localalignments”，详细给出了每一个比对到的重复序列与目的片段的匹配情况，第四部分是“Maskedregions”，仅显示重复序列，第五部分是“Summarytables”，总结了重复序列类型及对应的比对次数与碱基长度，如下表所示：3、根据分析结果，选取重复度较高的序列，如L1或SINE1，通过化学合成的方法合成这部分序列。实施例2以HER-2基因为例，使用生物素偶联的人类Cot-1DNA去除模板中的对应重复序列，标记后得到的探针使用特异性重复序列封闭。1、HER-2BACDNA片段化使用超声打断仪将HER-2BACDNA打断，使其主带位于250-1000bp。2、采用随机引物标记法制备生物素偶联的人类Cot-1DNA，标记体系如下：体系100μL250μLHumanCot-1DNAN1(0.4-0.8μg)N1(1-2μg)2.5×Buffer40μL100μLBiotin-N8N2(8-10μg)N2(20-25μg)dH2O26-N1-N265-N1-N2dNTP32μL80μLKlenowFragment(5U/μL)2μL5μL具体操作如下：1.一步(冰上)吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。二步(冰上)吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μLStopBuffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中。3、生物素偶联的人类Cot-1DNA与片段化的HER-2BACDNA杂交100ng片段化的HER-2BACDNA与2.5μg生物素偶联的人类Cot-1DNA杂交，总体积15μL。95℃变性10min，65℃杂交过夜，产物中加入15μL洗涤后的MyOneTMStreptavidinC1(Invitrogen65002)磁珠，室温结合30min，磁力架吸附3min，转移上清至新的EP管。上清使用DNA纯化试剂盒纯化，得到一次去重的HER-2DNA模板。4、采用随机引物标记法制备HER-2探针，标记体系如下：体系10μL20μL25μL一次去重的HER-2DNAN(40-80ng)N(80-160ng)N(100-200ng)2.5×Buffer4μL8μL10μLdH2O1-N2-N2.5-N缺CdNTP1.6μL3.2μL4μLCy3-dCTP3.2μL6.4μL8μLKlenowFragment(5U/μL)0.2μL0.4μL0.5μL具体操作如下：1.一步(冰上)吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。二步(冰上)注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μLStopBuffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于5μLddH2O中。瞬时离心后，取5μLHER-2探针、5μL着丝粒探针(制备方法与HER-2探针类似)、5μL1mg/mL特异性重复序列、85μL杂交液(比例为1:1:1:17)，即成HER2/CSP17双色探针。用所制得的探针用于乳腺癌FFPE样本的检测，结果见图3。实施例3以HER-2基因为例，先采用随机引物法标记探针，再使用生物素偶联的人类Cot-1DNA和合成的携带生物素标记的特异重复序列去除探针中的重复序列探针，得到特异性探针。1、采用随机引物标记法制备HER-2探针，标记体系如下：体系10μL20μL25μLHER-2DNAN(40-80ng)N(80-160ng)N(100-200ng)2.5×Buffer4μL8μL10μLdH2O1-N2-N2.5-N缺CdNTP1.6μL3.2μL4μLCy3-dCTP3.2μL6.4μL8μLKlenowFragment(5U/μL)0.2μL0.4μL0.5μL具体操作如下：1.一步(冰上)吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。二步(冰上)注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μLStopBuffer终止反应2-3min，待用。2、采用随机引物标记法制备生物素偶联的人类Cot-1DNA，标记体系如下：体系100μL250μLHumanCot-1DNAN1(0.4-0.8μg)N1(1-2μg)2.5×Buffer40μL100μLBiotin-N8N2(8-10μg)N2(20-25μg)dH2O26-N1-N265-N1-N2dNTP32μL80μLKlenowFragment(5U/μL)2μL5μL具体操作如下：1.一步(冰上)吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。二步(冰上)吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μLStopBuffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中。3、生物素偶联的人类Cot-1DNA、合成的生物素修饰的特异重复序列与标记得到的HER-2探针杂交向HER-2探针标记体系中加入25倍(摩尔比)生物素偶联的人类Cot-1DNA、25倍(摩尔比)合成的生物素修饰的特异重复序列及杂交液，总体积50μL。95℃变性10min，46℃杂交过夜，产物中加入15μL洗涤后的MyOneTMStreptavidinC1(Invitrogen65002)磁珠，室温结合30min，置于磁力架上吸附3min，转移上清至新的EP管。使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中。此时得到的探针即为HER-2特异性探针。实施例4以HER-2基因为例，先采用随机引物法标记探针，再使用人类Cot-1DNA和合成的特异重复序列对重复序列进行封闭。2、采用随机引物标记法制备HER-2探针，标记体系如下：体系10μL20μL25μLHER-2DNAN(40-80ng)N(80-160ng)N(100-200ng)2.5×Buffer4μL8μL10μLdH2O1-N2-N2.5-N缺CdNTP1.6μL3.2μL4μLCy3-dCTP3.2μL6.4μL8μLKlenowFragment(5U/μL)0.2μL0.4μL0.5μL具体操作如下：1.一步(冰上)吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。二步(冰上)注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μLStopBuffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中，即成HER-2探针。2、取5μLHER-2探针、5μL着丝粒探针(制备方法与HER-2探针类似)、5μL2mg/mL人类Cot-1DNA、5μL1mg/mL特异性重复序列、80μL杂交液(比例为1:1:1:1:16)，即成HER2/CSP17双色探针。当前第1页1 2 3