本发明涉及烟用添加剂技术领域，具体是一种发酵山楂香料的制备方法及其应用。
背景技术：
再造烟叶，主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成。再造烟叶存在杂气重、刺激性大和口感不适等吸味缺陷，影响了再造烟叶在卷烟产品中的使用效果和添加量。国内通常的做法是采用添加剂的办法来进行改善，目前应用较多的添加剂是烟草、天然植物类提取物，这些提取物一般通过水、醇提取或分子蒸馏得到，添加后对卷烟质量的改善程度有限，仍有刺激性大、杂气多等缺陷。为了使再造烟叶外观、评吸品质更接近于优质烟叶，通常还需要对再造烟叶进行加香处理，而现有技术生产的再造烟叶及其裹衣还存在燃烧过程中产生较多木质气、刺辣感而影响卷烟烟气清纯气味等问题。
山楂(Crataegus pinnatifida Bunge)，又名山里果、山里红，蔷薇科山楂属，核果类水果，核质硬，果肉薄，味微酸涩。到目前为止，从山楂(果肉、核及叶)中发现且分离得到的物质有150多种，其中主要有黄酮类、低聚黄烷类、有机酸类，另外还含有三萜类、甾体类和有机胺类等，其中含有的阿魏酸是香兰素的微生物转化前体物质。山楂中的天然色素为矢菊色素-3-半乳糖苷、矢车菊色素的双糖或三糖苷(含量为19.6％)等花色苷类化合物。山楂的药理作用有：助消化、降压、降血脂、抗氧化、强心、抑制血小板聚集、免疫调节、抗菌、抑制畸变、防癌、保护视网膜等作用。由于山揸含酸量高，并富台果胶、丹宁，果肉质地紧密，果核坚硬且所占比例较大，给山楂的深加工带来较大困难。许多年来，山揸加工一直局限在干制品、糖制品、饮料制品及罐装制品方面，如山揸糖葫芦、山楂片、山揸糕、果丹皮、山楂酱、山揸蜜饯、山楂汁以及山楂罐头等产品较为多见，而难以形成大规模、工业化、多档次、多品种的生产，阻碍了山揸这一我国特有宝贵水果资源的加工转化及全方位利用。另外，对山揸黄酮类成分的提取及研究亦在日益深化。除此以外，山楂还含有丰富的红色素。为了充分开发利用天然资源，从山楂中提取天然食用色素等生物活性成分，为我国山揸果的深层次加工、提高附加值开辟了新的途径，提高山楂产品的经济效益和社会效益。
而在卷烟产品中，过量的纤维素、蛋白质等大分子物质会赋予烟气尖刺和灼热感并产生呛咳。纤维素可被生物酶定向水解生成葡萄糖、低聚糖等，能有效降低卷烟的刺激性，减轻杂气和改善吸味，但是糖过多也会使烟气焦油量增大。而微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以山楂为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。
现有技术中，以山楂提取液为底物，以产香菌食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1发酵，制备发酵山楂香料及其在再造烟叶和裹衣中应用，改善再造烟叶的口感吸味，并使外观接近优质烟叶，尚未见报道。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种发酵山楂香料的制备方法，并在再造烟叶和裹衣进行应用，可提高再造烟叶香气质、降低刺激、减少杂气，并能使再造烟叶和裹衣更接近于优质烟叶的外观色泽。
本发明提供一种发酵山楂香料的制备方法，其利用产香菌食甲醇芽孢杆菌VJ4-1发酵山楂香料，包括以下步骤：
1)将山楂粉与水按质量比1:10～40混合、60～75℃提取3～5小时，抽滤，将滤渣重复提取2～3次，合并滤液，灭菌；
2)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌VJ4-1活化培养，得到食甲醇芽孢杆菌活化液；菌株活化条件为：25～35℃、pH4～7条件下，100～150r/min震荡培养24～72小时，所述的产香菌食甲醇芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)VJ4-1保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2012004，保藏日期：2012年1月11日；
3)发酵：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比5～20％接种到上述步骤1)中的山楂合并滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为20～40％，接种后的发酵培养条件同活化培养条件；培养时间为1～7天；
4)将步骤3)中所得的发酵液减压浓缩至相对密度1.2～1.3，与95％乙醇按质量比1：3～4沉淀过夜后抽滤，将滤液减压蒸馏除去溶剂，制得深红褐色浸膏为发酵山楂香料。
进一步的，所述步骤4)中减压减压蒸馏的温度为55～65℃。
本发明还提供一种上述方法制备的发酵山楂香料在再造烟叶中的应用，所述发酵山楂香料加入再造烟叶中的质量比是0.05～0.3％。
本发明还提供一种上述方法制备的发酵山楂香料在再造烟叶裹衣中的应用，所述发酵山楂香料加入再造烟叶裹衣中的质量比是0.05～0.1％。
采用GC/MS对本发明制备的产香菌发酵山楂香料与未发酵山楂香料(以下简称对照)进行挥发性致香成分GC/MS对比分析。
(1)同时蒸馏萃取
将5g发酵山楂香料或对照装入圆底烧瓶中，加入400mL水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取2h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至1mL，浓缩液用于进行GC/MS分析。
(2)GC/MS分析：HP-5MS(50m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度：250℃；分流比20:1；载气：He，1mL/min；升温程序：从50℃(1min)以5℃/min升到250℃(5min)；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70eV；扫描范围：50～550amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。
(3)挥发性成分对比分析
通过GC/MS对本发明的产香菌发酵山楂香料及其对照进行香气成分分析，从表1中可以看出，(1)发酵山楂香料一共鉴定出58种挥发性香气成分，未发酵山楂对照浸膏样品鉴定出34种挥发性成分；(2)发酵山楂香料新增35种挥发性香气成分，主要包括己酸、β-月桂烯、乙酸己酯、丁酸己酯、松油醇、香兰醇、香兰素、二氢猕猴桃内酯、苯乙醇及其他醇类、烯类、呋喃类、酮类等，其中己酸为低级脂肪酸、挥发性有机酸，对卷烟的烟气有利，使烟气醇和；β-月桂烯具有令人愉快的、清淡的香脂气味；乙酸己酯具有果香气；丁酸己酯呈青香、果香、酯香、蔬菜香及强烈的混合水果香气和菠萝香昧；松油醇似松针香气，在烟气中增加青香，在卷烟香味中起重要作用；香兰醇具有甜香、奶油、酚香、香荚兰及椰子香气，香兰素具有浓烈奶香气，通过高温能挥发到烟气中，增加卷烟烟气的香荚兰香气，协调烟香，增加烟气中的吡喃、吡啶类致香物质，提高卷烟烟气的香味成分，有效改善卷烟的感官质量，可能是山楂中的阿魏酸经微生物酶体系催化转化而来；二氢猕猴桃内酯，带有香豆素样香气，并有麝香样气息；苯乙醇，具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气；(3)发酵山楂香料中，己醛、糠醛、葵醛、棕榈酸乙酯等成分的含量有不同程度的提高。其中己醛呈生的油脂和青草气及苹果香味；糠醛具有杏仁香带焦香；棕榈酸乙酯是高级饱和脂肪酸，呈微弱蜡香、果爵和奶油香气，在卷烟烟气中具有柔和香气的作用；(4)发酵后，山楂中的一些成分消失或含量降低，如3-甲基-2-丁烯-1-醇、2,3-戊二酮、乙酸氯甲酯、乙缩醛、十三酸、邻苯二甲酸异丁酯、亚油酸、亚油酸乙酯、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯等，其中亚油酸、亚油酸乙酯属于不饱和酸、不饱和酸酯，邻苯二甲酸异丁酯、邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯属于有害刺激性成分，在热裂解过程中容易形成强烈刺激性和杂气物质，增加烟气对喉部的刺激性和粗糙感，对卷烟吸味有不利的影响，它们的含量经发酵后显著降低或消失，可能是因为经过微生物酶体系作用而分解、降解、转化，可能有利于卷烟品质的提高。总之，从挥发、半挥发性成分的变化看，经食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1转化发酵的山楂香料在卷烟中的加香效果可能比未发酵的山楂浸膏好。
表1.产香菌发酵山楂香料与其未发酵对照的挥发性成分GC/MS对比分析
表1中符号“/”表示未检出；内标为丙酸苯乙酯。
经过再造烟叶及裹衣加香评吸试验表明，所有这些香气糅合在一起赋予发酵山楂香料与烟气协调、酸甜奶香气，增加了烟气柔和感、降低刺激、减少杂气、改善吸味，并使再造烟叶及裹衣颜色更自然均匀，接近优质烟叶。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。
本发明的有益效果是：
1)本发明制备的产香兰素菌株食甲醇芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)VJ4-1发酵山楂香料，可用于再造烟叶及裹衣的加香。用于再造烟叶时，能协调烟气，使香气质提升，香气更丰富且带有明显的酸甜奶香气，同时还具有降低刺激，减少杂气的作用；用于卷烟纸时，能提升卷烟纸的品质，使其呈现天然本位的优质烟丝黄色且色调自然均匀，能很好地掩盖卷烟纸燃烧所产生的木质气、刺辣感。
2)采用本发明制备的发酵山楂香料，增香成分含量高，产品收率高，生产周期短，工艺条件温和，且所用的原料具有天然环保无害等优点，具与生产香兰素单一香料相比步骤简便可降低纯化成本，香气复合天然，有较大的工业应用转化前景。
具体实施方式
下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种发酵山楂香料的制备方法，包括如下步骤：
1)将山楂粉与水按质量比1:20混合、60℃提取3小时，抽滤，将滤渣重复提取2次，合并滤液，灭菌；
2)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌VJ4-1活化培养，得到食甲醇芽孢杆菌活化液；菌株活化条件为：25℃、pH4.5条件下，100r/min震荡培养24小时；
3)发酵：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比5％接种到上述步骤1)中的山楂合并滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为20％，接种后的发酵培养条件同活化培养条件；培养时间为2天；
4)将步骤3)中所得的发酵液减压浓缩至相对密度1.2～1.3，与95％乙醇按质量比1：3～4沉淀过夜后抽滤，将滤液减压蒸馏除去溶剂，制得深红褐色浸膏为发酵山楂香料，相对密度为1.0144。
该发酵山楂香料加入再造烟叶中的质量比是0.05％，能柔和烟气、丰富香气、减少刺激和杂气，使再造烟叶更有光泽、更贴近自然烟叶黄色。
该发酵山楂香料加入裹衣中的质量比是0.05％，能提升香气质、增加酸甜奶香气、降低刺激、余味干净，使裹衣显现接近烟叶的黄棕色。
实施例2
一种发酵山楂香料的制备方法，包括如下步骤：
1)将山楂粉与水按质量比1:15混合、65℃提取4小时，抽滤，将滤渣重复提取3次，合并滤液，灭菌；
2)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌VJ4-1活化培养，得到食甲醇芽孢杆菌活化液；菌株活化条件为：30℃、pH5条件下，110r/min震荡培养48小时；
3)发酵：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比10％接种到上述步骤1)中的山楂合并滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为30％，接种后的发酵培养条件同活化培养条件；培养时间为3天；
4)将步骤3)中所得的发酵液减压浓缩至相对密度1.2～1.3，与95％乙醇按质量比1：3～4沉淀过夜后抽滤，将滤液减压蒸馏除去溶剂，制得深红褐色浸膏为发酵山楂香料，相对密度为1.0201。
该发酵山楂香料在再造烟叶中的质量比是0.1％，和烟气协调、增加酸甜奶香、降低刺激，颜色更自然、有光泽。
实施例3
一种发酵山楂香料的制备方法，包括如下步骤：
1)将山楂粉与水按质量比1:40混合、70℃提取5小时，抽滤，将滤渣重复提取3次，合并滤液，灭菌；
2)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌VJ4-1活化培养，得到食甲醇芽孢杆菌活化液；菌株活化条件为：35℃、pH6条件下，130r/min震荡培养72小时；
3)发酵：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比20％接种到上述步骤1)中的山楂合并滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为40％，接种后的发酵培养条件同活化培养条件；培养时间为5天；
4)将步骤3)中所得的发酵液减压浓缩至相对密度1.2～1.3，与95％乙醇按质量比1：3～4沉淀过夜后抽滤，将滤液减压蒸馏除去溶剂，制得深红褐色浸膏为发酵山楂香料，相对密度为1.1417。
该发酵山楂香料加入再造烟叶中的质量比是0.3％，能与烟气较协调，增加香气、减少杂气、改善口感。
实施例4评吸实验
将制备的发酵山楂香料分别按与再造烟叶的质量比为0.3％、0.1％、0.05％的比例，未发酵山楂提取物浸膏(以下简称对照)按与再造烟叶的质量比为0.05％的比例，分别添加到再造烟叶中，依次记为1#、2#、3#、对照样品，进行评吸，评吸按照国标GB 5606.4-1996进行。
表2.发酵山楂香料在再造烟叶中的应用
根据上表2所示，本发明发酵山楂香料，加入再造烟叶中进行加香比例为0.05％～0.3％时，与烟气协调性好，有特征酸甜奶香，香气丰富，烟气柔和、细腻，刺激降低，杂气减少、吸味改善，并能改善再造烟叶及裹衣，使其外观颜色自然均匀，接近于优质烟叶。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。