一种水稻直立密穗DEP1基因人工定点突变体及其应用的制作方法

文档序号：12249099阅读：507来源：国知局

本发明涉及水稻基因组编辑育种领域，尤其涉及一种水稻直立密穗DEP1人工定点突变体及其应用。

背景技术：

水稻是我国重要的粮食作物之一，稻谷产量占粮食作物的40％左右。提高水稻产量，对保障国家粮食安全有重大的意义。中国水稻产量的提高主要有两个时期：第一个时期是20世纪50年代，兴起了矮化育种，即“矮秆革命”或“绿色革命”，第二个时期是20世纪70年代以来杂交水稻的广泛推广。水稻专家陈温福认为杂种优势利用与理想株型相结合的超高产育种，必将是未来水稻产量提高的突破点。

直立穗是水稻高产品种的理想株型之一，直立穗型水稻穗长较短、着粒密度大、叶片较直、叶夹角小、群体结构好，有利于光能利用率的提高和水稻光合产物的积累。2009年控制水稻直立穗型和穗粒数的多效基因DEP1从东北超级稻品种沈农265中图位克隆，该基因共有5个外显子和4个内含子，编码的多肽具有与磷脂乙醇酰胺结合蛋白相似的功能。序列比对发现沈农265之所以高产是因为该基因在第5外显子缺失637bp碱基，并插入了12bp碱基，能够造成转录提前终止，使得水稻穗变密，枝梗数和穗粒数增加，水稻产量大幅增加。

目前在生产上广泛应用的DEP1高产类型的等位基因与沈农265的基因型一致，然而这种高产基因型是在自然突变条件下产生的，高产的效果是否达到DEP1基因的最大潜力还不确定。

技术实现要素：

本发明公开了一种水稻直立密穗DEP1人工定点突变体及其应用。本发明通过对直立密穗DEP1基因的第5显子进行人工突变，影响DEP1基因的正常翻译，导致基因功能丧失或弱化从而进一步提高水稻的产量。

本发明的技术方案如下：一种水稻直立密穗DEP1基因人工定点突变体，所述水稻直立密穗DEP1基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对DEP1基因的第5外显子修饰，使得第5外显子的碱基发生替换、缺失和/或插入(三种突变方式可随机组合)获得DEP1基因人工定点突变体；

修饰靶点位于第5外显子一段重复序列内，第一靶点位置位于第5外显子第499-519碱基处，第二靶点位于第5外显子第530-549碱基处，两个修饰靶位点序列均为AGCTGCGGTTGCAACGGCTG。

本发明通过CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术使得第5外显子的碱基发生替换、缺失或插入而获得的7个DEP1等位基因，这些等位基因均能够提高水稻产量。

所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第二靶点第544-547碱基造成4个碱基CGGC的缺失，得到DEP1基因突变体DEP1-D1，突变体DEP1-D1的第5外显子碱基序列如SEQ ID NO.1，该突变体能提高水稻产量10％左右。

进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第二靶点处的31个碱基CTTCCAAGCTGCGGTTGCAACGGCTGCGGCT采用10个碱基TGTCCAAGCT替换，得到DEP1基因突变体DEP1-D2，突变体DEP1-D2的第5外显子碱基序列如SEQ ID NO.2，该突变体能提高水稻产量20％以上。

进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第一靶点第515-516碱基造成2个碱基GG的缺失，在第二靶点第546与547碱基之间插入1个碱基A，得到DEP1基因突变体DEP1-D3，突变体DEP1-D3的第5外显子碱基序列如SEQ ID NO.3，该突变体能提高水稻产量20％以上。

进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第一靶点第515～517碱基造成3个碱基GGC的缺失，第二靶点第538～552碱基造成15个碱基TTGCAACGGCTGCGG的缺失，得到DEP1基因突变体DEP1-D4，突变体DEP1-D4的第5外显子碱基序列如SEQ ID NO.4，该突变体能提高水稻产量30％以上。

进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第一靶点第517与518碱基之间造成1个碱基C的插入，得到DEP1基因突变体DEP1-D5，突变体DEP1-D5的第5外显子碱基序列如SEQ ID NO.5，该突变体将水稻产量提高45％以上。

更进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第一靶点第516-517碱基造成2个碱基GC的缺失，同时第518-519碱基TG变为GT，在第二靶点第544～547碱基有4个碱基CGGC的缺失，从而得到DEP1基因突变体DEP1-D6，突变体DEP1-D6的第5外显子碱基序列如SEQ ID NO.6，该突变体能够将水稻产量提高50％以上。

更进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在第二靶点造成第545-546碱基处2个碱基GG的缺失，得到DEP1基因突变体DEP1-D7，突变体DEP1-D7的第5外显子碱基序列如SEQ ID NO.7，该突变体能将水稻产量提高50％以上。

本发明还提供所述水稻直立密穗DEP1基因人工定点突变体在杂交水稻育种和基因组编辑水稻育种中的应用。

本发明的机理如下：本发明通过针对水稻直立密穗DEP1基因，使用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在DEP1基因的第5外显子设计靶点进行定点突变，从而产生不同的突变类型，即不同的等位基因。为了能使DEP1基因第5外显子能够产生大片段碱基的缺失或改变，本发明特别选择了在第5外显子中的一段重复序列内设计两个靶点，这样设计的靶点序列就可以同时靶向两个位置，容易造成大片段的缺失，继而更容易阻碍第5外显子的正常翻译，弱化基因功能，从而提高水稻产量。本发明通过观察这些不同类型的突变对水稻产量的影响，筛选出表现优异的突变类型，优异的突变类型能够将水稻产量提高45％以上，优于自然界中的突变类型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用CRISPR/Cas9对直立密穗DEP1基因的第5显子进行人工突变，并筛选出能够显著提高水稻产量的突变体。本发明提供的DEP1基因突变体能够将水稻产量提高到50％以上，甚至优于自然界的突变类型。

附图说明

图1为DEP1基因突变体DEP1-D1第五外显子碱基序列图；

图2为DEP1基因突变体DEP1-D2第五外显子碱基序列图；

图3为DEP1基因突变体DEP1-D3第五外显子碱基序列图；

图4为DEP1基因突变体DEP1-D4第五外显子碱基序列图；

图5为DEP1基因突变体DEP1-D5第五外显子碱基序列图；

图6为DEP1基因突变体DEP1-D6第五外显子碱基序列图；

图7为DEP1基因突变体DEP1-D7第五外显子碱基序列图；

图8为野生型直立密穗DEP1基因第五外显子碱基序列图；

注：图中黑色加粗区域为靶点序列，插入的碱基采用斜体表示，缺失的碱基采用“-”表示。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1

DEP1基因的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

DEP1基因的第5外显子碱基序列(野生型)如SEQ ID NO.9所示，见图8。

本实施例基于CRISPR/Cas9技术设计了DEP1基因第5外显子的靶点，选择了2个序列接近并且一致的靶点AGCTGCGGTTGCAACGGCTG，第一靶点位置位于第5外显子第499-519碱基处，第二靶点位于第5外显子第530-549碱基处。本实施例将靶点序列进行合成，

Oligo15’-GGCAAGCTGCGGTTGCAACGGCTG-3’，

Ologo2：5’-AAACAGCTGCGGTTGCAACGGCTG-3’。

本实施例使用含有cas9表达盒(35S启动子启动)和guid RNA表达盒(水稻OsU3启动子)的双元载体Pcambia1300为骨架载体进行载体构建，将靶点序列插入骨架载体中，具体做法为：将Oligo1与Oligo2进行退火磷酸化，使用限制性内切酶AarⅠ对骨架载体进行酶切，然后使用T4连接酶将退火磷酸化后的靶点序列连入骨架载体OsU3启动子与sgRNA-scaffold序列之间，完成载体构建。

载体构建后，将载体转入农杆菌EHA105，以水稻中的粳稻品种日本晴作为受体进行农杆菌转化。在经过筛选，分化，生根过程后获得T0代转基因植株。采集T0代植株叶片提取DNA,在DEP1基因第5外显子的2个靶点外围设计检测引物进行PCR检测，检测引物为：

DEP1-test-f:TGCCAAACTGAGCTTTTACATGG，

DEP1-test-r:TGAAGATGTTGAAGCAGCTGGAG。

将PCR产物进行SANGER测序，确定发生突变的T0代植株。

将在T0代检测到有突变现象的植株进行收种，进行T1代的种植，采集T1代植株叶片提取DNA，使用如上的检测引物进行检测，确定DEP1基因突变类型为纯合突变或杂合突变；同时设计潮霉素(全写)检测引物，引物序列为：HYG-f:CTATTTCTTTGCCCTCGGAC,HYG-r:CCTGACCTATTGCATCTCCC，检测潮霉素片段的存在，以此确定外源载体T-DNA片段是否存在。筛选出7种DEP1突变类型为纯合突变同时HYG检测为阴性的植株进行收种。

将T1代筛选出的植株进行收种，进行T2代的种植，每种突变类型种植49株。理论上T2代为7种突变类型的纯合突变体。为了验证这一点，随机筛选部分植株进行了基因型检测，证明T2代植株确实为7种突变类型的纯合突变体。为了确定7种突变类型对产量的影响，在T2代的成熟期，对每种基因型的结实率、穗粒数、有效穗、千粒重和单株产量等产量指标进行了统计，发现7种DE P1基因突变体都显著增加单株产量。

相应突变体如下：DEP1-D1第二靶点4个碱基缺失，第二靶点序列变为AGCTGCGGTTGCAA----TG，第5外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.1所示；见图1。

DEP1-D2第二靶点以及前后的31碱基被10碱基替换，第一靶点到第二靶点之间的序列变为AGCTGCGGTTGCAACGGCTGTGGCTGTCCAAGCT，第5外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.2所示；见图2。

DEP1-D3第一靶点2碱基缺失，第二靶点单碱基插入，第一靶点到第二靶点的序列变为AGCTGCGGTTGCAAC--CTGTGGCCTTCCAAGCTGCGGTTGCAACGGACTG，第5外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.3所示；见图3。

DEP1-D4第一靶点3碱基缺失，第二靶点及其后的15碱基缺失，第一靶点到第二靶点的碱基序列变为：AGCTGCGGTTGCAAC---TGTGGCCTTCCAAGCTGCGG---------------；第5外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.4所示；见图4。

DEP1-D5第一靶点单个碱基插入，第一靶点的碱基序列变为AGCTGCGGTTGCAACGGCCTG，第5外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.5所示；见图5。

DEP1-D6第一靶点2碱基缺失，第一靶点最后两个碱基TG变为GT，第二靶点4碱基缺失，第一靶点到第二靶点的碱基序列变为AGCTGCGGTTGCAACG--GTTGGCCTTCCAAGCTGCGGTTGCAA----TG，第5外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.6所示；见图6。

DEP1-D7第二靶点2碱基缺失，第二靶点碱基序列变为：AGCTGCGGTTGCAAC--CTG第5外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.7所示，见图7。

7种DEP1基因突变体对单株产量的影响，如表1所示。

表1

注：“ns”表示在0.01及0.05水平差异均不显著，“*、**”分别表示在0.05、0.01差异达显著水平；D1-D7为7种突变体，wide为野生型对照。

由表1可知，7种DEP1的基因突变体的增产幅度从13％～51％不等，其中DEP1-D6和DEP1-D7的增产效果最显著，达到了50％以上，远远优于自然界中的突变类型。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南纳博生物科技有限公司

<120> 一种水稻直立密穗DEP1基因人工定点突变体及其应用

<130> 20160728

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcaaaattg tgtatctgca tttcatgtct ttgctactgt tgcaagtgct cacccaagtg 60

caaaagacca aggtgcctca attgttcttg cagctcatgc tgcgacgagc catgctgtaa 120

gccaaactgc agtgcgtgct gcgctgggtc atgctgtagt ccagactgct gctcatgctg 180

taaacctaac tgcagttgct gcaagacccc ttcttgctgc aaaccgaact gctcgtgctc 240

ctgtccaagc tgcagctcat gctgcgatac atcgtgctgc aaaccgagct gcacctgctt 300

caacatcttt tcatgcttca aatccctgta cagctgcttc aagatccctt catgcttcaa 360

gtcccagtgc aactgctcta gccccaattg ctgcacttgc acccttccaa gctgtagctg 420

caagggctgt gcctgtccaa gctgtggatg caacggctgt ggctgtccaa gctgcggatg 480

caacggttgt ggctgtccaa gctgcggttg caacggctgt ggccttccaa gctgcggttg 540

caatgcggct cgtgctcttg cgcccaatgc aaacccgatt gtggctcgtg ctctaccaat 600

tgctgtagct gcaagccaag ctgcaacggc tgctgcggcg agcagtgctg ccgctgcgcg 660

gactgcttct cctgctcgtg ccctcgttgc tccagctgct tcaacatctt caaatgctcc 720

tgcgctggct gctgctcgag cctgtgcaag tgcccctgca cgacgcagtg cttcagctgc 780

cagtcgtcat gctgcaagcg gcagccttcg tgctgcaagt gccagtcgtc ttgctgcgag 840

gggcagcctt cctgctgcga gggacactgc tgcagcctcc cgaaaccgtc gtgccctgaa 900

tgttcctgtg ggtgtgtctg gtcttgcaag aattgtacag agggttgtcg atgcccacgg 960

tgtcgtaacc catgctgtct cagtggttgc ttatgttga 999

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