一种番茄SolyWRKY54转录因子调控番茄黄化曲叶病毒的鉴定及应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，涉及番茄中的一个wrkyiii类转录因子solywrky54的功能研究及应用。solywrky54基因在不同番茄品种中响应番茄黄化曲叶病毒的模式为进一步深入研究wrky转录因子响应番茄黄化曲叶病毒提供了依据。

背景技术：

番茄(solanumlycopersicuml.)，又名西红柿，起源于南美洲西部，属于一年生草本植物。番茄被广泛应用于各种科学研究，如育种、果实发育成熟、抗逆防御调节等(cuarteroetal.，jexpbot2006，57：1045-1058；kennedyetal.，annureventomology2003，48：51-72；kleeetal.，annurevgenet2011，45：41-59；schaueretal.，plantcell2008，20：509-523)。

番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlyvirus，tylcv)是一类基因组大小为2.7～2.8kb的单链环状dna病毒(regenmorteletal.，archvirol2000，145：2227-2232)。tylcv主要通过烟粉虱感染双子叶植物，如番茄、烟草、棉花等(jonesetal.，eurjplantpathol2003，109：195-219)。植物感染tylcv症状比较明显，会造成整个叶片黄化、萎缩、褶皱，果实成熟期延长，严重影响产量及品质(glicketal.，plantprotectsci2009，45：81-97)。

wrky转录因子因其n-端含有wrky结构域(wrkygqk)而命名(eulgemetal.，trendsplantsci2000，5：199-206)。wrky转录因子已在多种植物中得到鉴定，如白菜、拟南芥、茶树、水稻、杨树等(tangetal.，plantmolbiolrep2014，32：781-795；wuetal.，molgenetgenomics2016，291：255-269；wangetal.，bioldirect2015，10：1-27)。与i、ii类亚族相比，wrkyiii类转录因子c端含有c2hc(c-x7-c-x23-h-x1-c)的锌指结构。wrkyiii类转录因子基因的表达受各种环境条件的影响，如病原菌、逆境胁迫、衰老等(maoetal.，plantcellphysiol2007，48：833-842；zhouetal.，plantphysiolbioch2015，96：311-320；besseauetal.，jexpbot2012，63：2667-2679)。

技术实现要素：

本发明获得了一种响应番茄黄化曲叶病毒的番茄solywrky54转录因子基因。番茄solywrky54基因的功能研究及应用，为进一步深入研究番茄响应tylcv的防御机制提供理论基础。

附图说明

图1.番茄wrky家族的进化树分析，方框标注的为番茄solywrky54转录因子。

图2.不同抗性番茄品种tylcv病毒积累含量测定。

图3.番茄solywrky54基因在不同番茄品种中响应tylcv的表达分析。

图4.病毒诱导基因沉默验证番茄solywrky54基因功能。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，具体实验步骤如下：

1.番茄转录因子基因solywrky54基因的克隆

利用rnasimpletotalrnakit(天根生化科技有限公司，北京)和primescriptrtreagentkit(宝生物工程有限公司，大连)提取番茄‘浙杂301’叶片的rna并反转成cdna。以‘浙杂301’cdna为模板，根据特异引物(正向：5’-atggattgtggattcaattatgaat-3’，反向5’-ttatctgaaaaaatcagagaaatttg-3’)进行扩增。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min10s，共35个循环；72℃延伸10min。将目的条带用质量体积分数1.2％琼脂糖凝胶电泳进行回收，连接pmd18-t载体(宝生物工程有限公司，大连)，转化大肠杆菌dh5α，提取质粒经pcr检测后挑取阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

2.不同番茄品种tylcv病毒含量测定

根据tylcv基因组序列(ncbi登录号：am282874.1)，设计一对检测引物用于半定量pcr，正向：5’-atgtcgaagcgaccaggcgatataat-3’，反向5’-ttaatttgatattgaatcatagaaat-3’。提取对照及感染tylcv7d的抗病番茄品种‘浙杂301’(浙江省农科院蔬菜所，杭州)及感病番茄品种‘金棚1号’(西安金鹏种苗有限公司，西安)叶片dna。番茄tubulin基因作为参照基因，检测不同番茄品种tylcv病毒含量(chenetal.，plosone2013，8：e80816)。

3.实时定量pcr反应

携带tylcv的烟粉虱饲养在防虫温室中。将长至2叶状态的‘浙杂301’和‘金棚1号’番茄幼苗放于防虫温室中感染tylcv2、4、6、8、10d，取叶片样本用于提取rna。荧光定量pcr使用sybrpremixextaqkit(宝生物工程有限公司，大连)按操作说明完成。根据solywrky54基因序列设计特异性的引物进行荧光定量pcr。引物：5’-ccacagaaacataaacacaagaaac-3’，反向5’-aggagagacaaaagatggtgaataa-3’。

4.病毒诱导基因沉默及tylcv含量测定

将扩增好的solywrky54基因片段构建到ptrv2载体(liuetal.，plantj2002，30：415-429)。将重组质粒ptrv2-solywrky54，ptrv2-pds(八氢番茄红素脱氢酶)及ptrv1，ptrv2质粒导入农杆菌gv3101(北京天恩泽基因科技有限公司，北京)。将菌液注射入‘浙杂301’子叶中，7d后，取对照组(ptrv1+ptrv2)及处理组番茄叶片冻于液氮并保存在-80℃冰箱中。将沉默后的番茄幼苗接种tylcv病毒，一周后取样提取dna，检测病毒含量。设计特异引物，检测tylcv病毒表达检测引物，正向：5’-agtaccgcaactgtgaagaatgatt-3’，反向5’-catacttggctgcctcctgatgat-3’。

5.试验结果：

1)接种tylcv7d后，感病品种‘金棚1号’叶片中病毒含量高于抗病品种‘浙杂301’(图1)。

2)本发明分析鉴定到的番茄solywrky54转录因子属于wrkyiii类亚族(图2)。

3)荧光定量pcr结果显示番茄solywrky54响应tylcv感染。在抗病品种‘浙杂301’中，solywrky54表达量降低。感病品种‘金棚1号’中，solywrky54表达呈现先上升后下降的趋势，在处理4d时表达量达到峰值，表达量增加了1.7倍(图3)。

4)病毒诱导基因沉默表明，番茄solywrky54负调控tylcv的感染。与对照组相比，沉默后的solywrky54表达量降低50％，病毒含量则为对照组的10％(图4)。