循环肿瘤细胞的分离和检测方法与流程

本发明属于肿瘤研究领域，具体来说涉及分离和检测循环肿瘤细胞(CTC)的新方法，其是一种不依赖于血液细胞肿瘤标志物的方法。

背景技术：

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是指从肿瘤上脱落并进入循环系统的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖，部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质，增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离，这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。

最近的研究认为CTC含有能够引发转移性肿瘤生长的细胞，是大多数癌症的死亡原因。肿瘤细胞从原发肿瘤转移涉及了多个过程，包括局部肿瘤细胞的侵袭和迁移并进入淋巴系统或血液循环系统(血管内)，在循环过程中存活，外渗到远处器官转移，最后发展成病灶。对CTC细胞进行分析有助于我们理解肿瘤的侵袭和转移。CTC同时也可以作为个体化治疗的重要的标志物。CTC技术可以运用于包括预测癌症患者的临床结果，潜在转移早期诊断，监测治疗效果。然而，癌症患者每毫升血液中含有数十亿个红细胞和数百万个白细胞，只含有1～10个的CTC细胞，CTC细胞的数量如此之低使得分离和分析这些细胞成为一种挑战。

分离富集CTC最常见的方法是利用肿瘤细胞表达的上皮细胞标志物(如上皮细胞黏附分子EpCAM)和抗体来捕获和选择。Veridex公司的CellSearch是FDA批准的唯一一种CTC临床检测系统，它能有效定义上皮来源的CTC，即EpCAM、DAPI和细胞角蛋白阳性，而CD45阴性。CellSearch是基于阳性选择，利用抗体包被的磁珠来捕获EpCAM阳性的细胞，然后成像并计数。CellSearch被FDA批准用于对转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌进行治疗监测。

另外，ScreenCell系统是一种可一次性利用肿瘤细胞的大小对其进行分离的过滤装置。此过滤装置利用膜原理对全血中体积较大的CTC进行截留，而将非肿瘤细胞滤过除去。

然而，与肿瘤细胞本身一样，CTC细胞是一个高度异质的群体，一些CTC有能力产生新的肿瘤，而另一些则没有；一些CTC表现出肿瘤干细胞的特性，而另一些则不是。CTC会发生一些上皮间质转化，导致细胞标记物表达和细胞大小的变化，因此，这些方法不能检测到所有的CTC。更加重要的是，一些CTC可能来自机械脱落而不是主动侵袭，以及一些CTC可能失去生存能力或功能，因此与肿瘤转移无关，因此，这些方法计算的CTC细胞数不能准确地反应癌症的预后和治疗效果。

另一种实用的CTC分离方法是通过胶原粘附基质检测，可以检测和分离具有侵袭表型的CTC。这种方法是基于肿瘤细胞附着和摄取胶原蛋白的粘附基质的能力。然而，该方法并非基于实际的迁移或侵袭，因此，并不能确定分离得到的细胞具有真实的侵袭能力。

技术实现要素：

为了克服现有方法的局限性，我们基于肿瘤细胞的迁移和侵袭能力以及能够进入血液循环的能力开发了一种CTC的分离和检测的新方法。

本发明的第一方面提供了一种CTC分离方法。

本发明的CTC分离方法包括以下步骤：

(1)通过密度梯度离心从血液样本中富集单个核细胞(PBMC)；

(2)对富集的PBMC进行侵袭实验，收集具有侵袭性的细胞；

(3)对步骤(2)收集到的细胞进行染色和分选。

在一个特定的实施方案中，步骤(1)中密度梯度离心使用Ficoll淋巴细胞分离液进行；优选地，富集的PBMC用无血清培养基清洗、重悬；更优选地，所述无血清培养基为RPMI-1640。

在一个特定的实施方案中，步骤(2)中侵袭实验为Transwell小室侵袭实验；优选地，所述侵袭实验为富集的PBMC对Matrigel的侵袭实验。

在优选的实施方案中，步骤(2)中所述侵袭实验包括如下步骤：

a)在Transwell小室的内室中铺上一层Matrigel，37℃放置至少1小时以使其凝固；

b)把PBMC悬液加入Transwell小室的内室中，在外室加入含血清培养基(优选含10％FBS的RPMI-1640培养基)，置于5％CO2培养箱中37℃培养3～5天；

c)拿出培养盘，取出Transwell小室，小心弃掉内室中的培养基，并用湿润的棉签去除内室上表面的细胞和Matrigel，收集内室下表面的细胞。

在一个特定的实施方案中，步骤(3)中对细胞核进行DAPI染色，并通过抗细胞角蛋白抗体和抗CD45抗体进行细胞染色，选择DAPI染色阳性、细胞角蛋白阳性且CD45阴性的细胞；优选地，细胞分选通过流式细胞仪或荧光显微镜进行。

本发明的方法分离得到的CTC是具有侵袭性的循环肿瘤细胞，可进一步用于肿瘤转移研究等。

本发明的第二方面提供了一种CTC检测方法。

本发明的CTC检测方法包括以下步骤：

(1)通过密度梯度离心从血液样本中富集单个核细胞(PBMC)；

(2)对富集的PBMC进行侵袭实验，收集具有侵袭性的细胞；

(3)对步骤(2)收集到的细胞进行染色和计数。

在一个特定的实施方案中，步骤(1)中密度梯度离心使用Ficoll淋巴细胞分离液进行；优选地，富集的PBMC用无血清培养基清洗、重悬；更优选地，所述无血清培养基为RPMI-1640。

在一个特定的实施方案中，步骤(2)中侵袭实验为Transwell小室侵袭实验；优选地，所述侵袭实验为富集的PBMC对Matrigel的侵袭实验。

在一个优选的实施方案中，步骤(2)中所述侵袭实验包括如下步骤：

a)在Transwell小室的内室中铺上一层Matrigel，37℃放置至少1小时以使其凝固；

b)把PBMC悬液加入Transwell小室的内室中，在外室加入含血清培养基(优选含10％FBS的RPMI-1640培养基)，置于5％CO2培养箱中37℃培养3～5天；

c)拿出培养盘，取出Transwell小室，小心弃掉内室中的培养基，并用湿润的棉签去除内室上表面的细胞和Matrigel。

在一个特定的实施方案中，步骤(3)中对细胞核进行DAPI染色，并通过抗细胞角蛋白抗体和抗CD45抗体进行细胞染色，对DAPI染色阳性、细胞角蛋白阳性且CD45阴性的细胞进行计数；优选地，细胞计数通过荧光显微镜进行；更优选地，染色和计数直接在Transwell小室的内室下表面进行。

本发明的CTC检测方法不仅可以用于肿瘤转移研究，还可以用于癌症的预后及治疗效果评估。

本发明的有益效果为：

1.本发明的方法不仅依靠细胞表面标记的检测，还基于CTC功能进行分离和检测，因而不受CTC异质性的影响，分离得到的CTC均为具有侵袭能力的肿瘤细胞。

2.相比现有技术中的最常用的免疫磁珠筛选方法(例如CellSearch)，本发明的方法能够分离得到更多的具有侵袭能力的CTC。

3.本发明的CTC分离和检测方法简单，不需要特殊的仪器，既可以在实验室中用于肿瘤转移研究，也可以将CTC检测作为癌症的预后和治疗效果的生物标志物液体活检。

附图说明

图1 CTC侵袭实验(CICA)方法示意图。三个步骤：I.密度梯度离心富集单个核细胞；II.富集的单个核细胞对Matrigel的侵袭实验；III.免疫染色并在荧光显微镜下计数细胞。

图2 CICA检测CTC细胞。对照裸鼠(Control组)或移植A549的小鼠(Tumor组)的血液样品都用CICA方法分析。细胞核用DAPI染色(蓝色)。GFP阳性细胞(绿色)、细胞角蛋白阳性细胞(红色)和CD45阳性细胞(红色)都是在荧光显微镜下观察。实验重复2次。

图3 CICA方法的变异系数。3只肺肿瘤转移的小鼠血液被平均分为3份并同时进行CICA分析。平均值和标准偏差都标注在图中。

图4 CICA方法检测晚期癌症患者CTC。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1移植异种肿瘤的小鼠CTC的检测

为了开发基于细胞侵袭能力的CTC分离和检测方法，我们首先建立了具有转移性肿瘤的小鼠模型。A549是一种非小细胞肺癌细胞株，能够稳定表达增强型绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)，被用来在裸鼠的侧翼生成肿瘤。当侧翼肿瘤达到直径1厘米时进行手术切除，60～70％的小鼠术后3个月出现肺部转移。

在手术后3个月进行全血收集。使用Ficoll淋巴细胞分离液对全血进行密度梯度离心，收集单个核细胞(PBMC)，用无血清的RPMI-1640细胞培养基清洗、重悬PBMC。

对富集的PBMC进行Transwell小室侵袭实验：实验前在Transwell小室的内室中铺上一层Matrigel，在37℃放置至少1小时以使其凝固。然后把PBMC悬液加入Transwell小室的内室中，在外室加入含10％FBS的RPMI-1640培养基，放入5％CO₂培养箱中37℃进行培养。培养3～5天后，拿出培养盘，取出Transwell小室，小心弃掉内室中的培养基，并用湿润的棉签去除内室上表面的细胞和Matrigel。

对Transwell小室下表面的细胞进行DAPI染色并在荧光显微镜下观察。侵袭性细胞在荧光显微镜下可以很直观地观察到，并对GFP阳性细胞进行计数(参见图2第2列)。虽然没有经过肿瘤细胞注射的小鼠(Control组)也能够检测到少量单个核细胞(参见图2Control组第1列DAPI染色结果)，但是这些细胞都不是GFP阳性细胞，而在移植有肿瘤的小鼠的血液单个核细胞中可以检测到GFP阳性细胞(参见图2 Tumor组第2列)。

为了确定这些GFP阳性细胞是否是上皮细胞，我们对这些侵袭细胞进行抗细胞角蛋白抗体和CD45抗体染色，发现这些细胞都是细胞角蛋白阳性和CD45阴性的，说明这些细胞都是肿瘤细胞。而且，移植肿瘤的小鼠的所有细胞角蛋白阳性细胞都为GFP阳性细胞，而在对照组小鼠中没有检测到细胞角蛋白阳性细胞(参见图2)。

我们称这种细胞侵袭的CTC检测方法为“CICA”。我们通过CICA方法从3只接种了A549的小鼠血液中分离CTC，并通过分离得到的CTC细胞数来分析CICA方法的变异系数。每一只小鼠的血样平均分成3份并分别做CICA，结果变异系数小于15％(参见图3)，这表明，CICA的方法分离具有侵袭能力的CTC结果是一致的。

实施例2 CICA检测CTC与浸润转移的相关性

为了证明CICA的效用性，我们在许多对照和A549移植瘤裸鼠上用CICA做检测。收集各移植肿瘤小鼠和对照小鼠的全血并用CICA的方法对CTC进行检测。我们在对照组小鼠中没有检测到细胞角蛋白阳性的CTC。相反，大多数移植肿瘤的小鼠的血液样本中含有22～78个具有侵袭能力GFP阳性的CTC(表1)。更有趣的是，一些移植肿瘤的小鼠没有检测到迁移的CTC(表1)。这些结果表明，CICA分离到的CTC与转移相关。

表1不同小鼠的CICA检测结果

实施例3 CICA与基于EpCAM的方法的比较

目前，CTC最常见的分离方法是利用CTC胞上皮标志物来进行的免疫磁珠分选。为了比较这两种方法，我们把移植A549的肿瘤小鼠的血液分成两份，并分别用这两种方法来分离CTC。结果表明，EpCAM免疫磁珠方法比CICA方法分离得到的CTC细胞多了40％以上(参见表2)。

然而，当免疫磁珠方法筛选得到的CTC进行侵袭实验时，只有约50％的细胞显示了侵袭能力。更有趣的是，免疫磁珠法筛选得到的侵袭细胞比直接用CICA方法分离的要少。由于免疫磁珠法筛选不会影响细胞的侵袭能力，这些结果表明，虽然以抗EpCAM抗体为基础的免疫选择筛选得到的CTC更多，但是其中有许多是不具有侵袭能力的，并且还有一些具有侵袭能力的CTC没检测到。

表2 CICA法与EpCAM选择法的比较

实施例4晚期癌症患者的CTC细胞检测

为了测试CICA是否能够检测人类CTC，我们用CICA方法对许多种晚期癌症患者的血样进行检测，同时用正常健康人的血样做为对照。无论肿瘤类型，利用CICA方法分离得到的癌症患者血液中的CTC显示为细胞角蛋白阳性和CD45阴性(参见图4)。在正常健康人血液中不能检测到CTC，而在癌症患者中检测到的CTC数量可变(参见表3)。这些数据表明，CICA方法可以用来分离人类的CTC。

表3.正常健康人和癌症患者用CICA法计算的CTC细胞数