一种SLAMF6蛋白的制备方法与流程

本发明涉及重组蛋白，具体涉及SLAMF6蛋白的制备方法。

背景技术：

SLAMF6是一种单链膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族里的CD2亚家族。SLAMF6在所有的NK细胞、T细胞和B淋巴细胞中都有表达。SLAMF6是一个同源二聚体，SLAMF6与SH2D1A、SHPs共同介导了酪氨酸的磷酸化过程。SLAMF6作为协同受体在NK细胞的活化过程发挥重要作用，SLAMF6同样在淋巴增生患者来源的NK细胞中介导了抑制反应，故通过重组表达该蛋白、在体外研究该蛋白的功能就显得非常重要。

按照宿主细胞类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统，通常情况下采用原核表达系统表达重组蛋白，该方法与其它系统相比简便快捷，成本较低。但是膜蛋白的原核表达绝大多数情况下表达出的蛋白为包涵体形式，而且复性困难，并且利用原核系统表达出的蛋白没有糖基化过程，很难生产出具有生物学功能的重组蛋白，传统的生产SLAMF6蛋白的方法为原核表达，表达差、复性困难，且纯化得到的蛋白缺乏糖基化，不能满足需求。

与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。如今，哺乳动物表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台，如抗体、生长因子、凝血因子、疫苗等。

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种SLAMF6蛋白的制备方法，使其更具有产业上的利用价值。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种表达量高且具有完全生物学活性的SLAMF6蛋白的制备方法。

本发明的SLAMF6蛋白的制备方法，包括将SLAMF6蛋白中基因进行序列优化的步骤。

进一步的，SLAMF6蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)对SLAMF6蛋白中基因进行序列优化，获得最适真核系统表达的序列，所述SLAMF6蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(2)通过真核抗性筛选，得到稳定高效表达SLAMF6蛋白的细胞株，真核抗性筛选方法为通过逐步改变真核抗生素的浓度，得到高表达的混合克隆；

(3)对细胞株进行培养，优化细胞培养工艺，得到细胞株分泌物SLAMF6蛋白，提高重组蛋白的分泌和表达；细胞液在温度37℃、湿度≥70％、CO₂浓度8％、转速110rmp的细胞培养箱内培养72h，然后转移至温度34℃、湿度≥70％、CO₂浓度8％、转速110rmp的低温培养箱内培养，在培养72h和120h时分别取细胞液进行细胞计数及计算细胞存活率，然后将葡萄糖溶液(SIGMA，储液浓度200mg/L)加入细胞液内，其浓度为1mg/L。

(4)通过对纯化流程控制，得到高纯度的蛋白，具体方法为通过提高柱效和柱子体积，提高SLAMF6蛋白的收率和缩短纯化时间，1L细胞上清液中加11.688g固体NaCl至浓度为0.2mol/L，分离上清液，采用离心方法分离，在离心机转速为12000rpm条件下，离心20min，分离出的上清液用0.22μm滤器过滤除菌、除杂质，使样品充分澄清；

选用GE品牌Ni Sepharose 6Fast Flow(FF)column，规格26mm*20mm，连接上AKTA Purification，正确运行系统，使用5CV(倍柱体积)的0.2mol/L的NaOH冲洗层析系统，浸泡3h进行内毒素灭活，然后用至少10CV去热源水冲洗层析系统至中性；使用5CV的控热源0.2mol/L的NiSO₄充分冲洗层析系统，以活化层析介质，然后用5CV去热源水冲洗层析系统将游离的NiSO4冲洗干净；使用5CV平衡Buff 1充分冲洗层析系统，然后将预处理后的样品以5ml/min的流速进行上样，上样完成后再用5CV平衡Buff 1充分冲洗层析系统；使用3CV平衡Buff 1和洗脱Buff 1，采用步级洗脱方式(分三步：E20、E50、E500)纯化目标蛋白。

取泳道4和泳道5合并，进行分子筛精细纯化，选用GE品牌Superdex 200，规格26mm*600mm，连接上AKTA Purification，正确运行系统，使用3CV的控热源水充分冲洗层析系统，将层析系统冲洗干净；使用3CV平衡缓冲液充分冲洗层析系统，然后将捕获回收的样品以2ml/min的流速进行上样，上样完成后再用3CV平衡缓冲液洗脱，根据纯化图谱接收样品馏分。

进一步的，步骤(2)中，所述的高表达且含有真核筛选抗性的载体是具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的真核表达载体。

进一步的，所述真核抗生素为G418、Zerocin、潮霉素、Puro和hygro中的一种，优选G418。

进一步的，稳定高效表达SLAMF6蛋白的所述细胞株为HEK293细胞、CHO-DG44、RAJI和JURKAT中的一种，HEK293细胞中优选293A、293F。

本发明的一种SLAMF6蛋白，所述SLAMF6蛋白具有完全的生物学活性，纯度大于95％，细菌内毒素小于1EU/μg。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明采用真核表达系统表达SLAMF6蛋白，提供了获得SLAMF6蛋白细胞株的方法，制备的SLAMF6蛋白具有很好的生物学活性，蛋白纯度达到95％以上，能很好的满足后续的研发需求；SLAMF6蛋白往往具有糖基化现象，根据该蛋白的特性，采用人HEK293细胞表达SLAMF6蛋白，更易获得具有生物活性的蛋白，通过真核表达载体上的抗性基因，利用合适的G418浓度进行抗性筛选，最终获得了表达SLAMF6蛋白的细胞株；本发明采用哺乳动物表达系统，通过对载体改造，用工程细胞HEK 293(人胚胎肾细胞)筛选出分泌表达该蛋白的细胞株，通过本发明制备SLAMF6蛋白，解决了原核表达SLAMF6蛋白表达差的问题，通过分泌表达克服了复性困难的的问题，同时人的细胞表达人的重组蛋白，具有更准确的糖基化，满足了研发需求；通过对现有的真核表达载体进行改造，获得高表达且具有抗性的表达载体，将SLAMF6蛋白基因克隆到改造的真核表达载体上，通过抗性筛选，获得高表达SLAMF6蛋白的细胞株，通过改变培养条件，优化纯化流程，最终得到具有完全生物学活性的高纯度SLAMF6蛋白，克服了原核表达该蛋白表达质量差，无法糖基化的缺陷。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明实施例一中SLAMF6蛋白纯化电泳图；

图2是本发明实施例一中最终纯化得到SLAMF6蛋白的电泳图；

图3是本发明实施例一中得到的SLAMF6蛋白活性测定数据图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下列举具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例并非用于限制本发明的保护范围，实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例一

1、对SLAMF6蛋白序列进行序列优化，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，获得最适真核系统表达的序列。

2、通过真核抗性筛选，得到稳定高效表达SLAMF6蛋白的细胞株，真核抗性筛选方法为通过逐步改变真核抗生素的浓度，得到高表达的混合克隆；

(1)G418最适浓度的确定，将状态良好的293F细胞以0.5*10⁶个/ml进行稀释后加入96孔板内，每个孔加入100μl细胞稀释液，共加24个孔，将G418粉末(生工生物工程有限公司)配置成浓度为100mg/ml的储液，96孔板内分别加入G418，G418添加浓度为0、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml、550μg/ml这12个浓度梯度，并做好平行对照，每日观察细胞状态，对比不同G418浓度的细胞状态与阴性细胞状态之间的差别，14天后，浓度梯度为400μg/ml的孔内细胞死亡率达50％，可确定对于该批细胞，G418的筛选浓度为400μg/ml，筛选时间为14天；

(2)将状态良好、适于转染的293F细胞稀释到1.0-1.2*10⁶个/ml，共20ml，取两个灭菌后的1.5ml EP管，在管内分别加入600μl的293Freestyle培养基(GIBCO公司)，取质粒20μg加入其中一个EP管内，标记为质粒混合物；取60μg聚醚酰亚胺(PEI)(厂商polysciences，浓度1mg/ml)加入另一个EP管内，标记为PEI混合物，两个EP管分别混匀后静置5min，将PEI混合液加入质粒混合液中，混匀后静置20min，在静置的过程中可轻轻晃动EP管使混合更加充分，标记为转染混合物；将转染混合物匀速均匀的滴加入待转染细胞内，边滴加边成圆周运动晃动待转染细胞的细胞瓶，将转染后的细胞放入温度37℃、湿度≥70％、CO₂浓度8％、转速110rmp的细胞培养箱内培养；

(3)转染过后的细胞液在细胞培养箱内培养48小时后取样进行记数，计算细胞成活率以及观察细胞状态。将转染后的细胞液稀释到0.5*10⁶个/ml，并分装成4瓶，分别加入300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的G418、以及不添加G418的阴性，每隔48小时分别取样进行计数传代，统计细胞存活率及观察细胞状态，以0.5*10⁶个/ml的密度进行传代，传代过程中需要进行换液，取所需体积母液放入15ml灭菌离心管中，以900-1100r/min的速度进行离心，离心后去掉上清液加入293Freestyle培养基(GIBCO公司)，并加入对应浓度的G418，在筛选过程中如果出现细胞存活率很低，状态较差的情况，可将G418浓度降低100μg/ml进行筛选。

3、细胞株放大培养及培养条件的优化；

14天后，稳定细胞株筛选完毕，将筛选完毕的稳定细胞株进行放大，放大过程中保持G418浓度，放大后及时将筛选完毕的细胞株进行冻存，将稳定细胞株放到所需的体积。将放大后的稳定细胞株的细胞液在温度37℃、湿度≥70％、CO₂浓度8％、转速110rmp的细胞培养箱内培养72小时，然后转移至温度34℃、湿度≥70％、CO₂浓度8％、转速 110rmp的低温细胞培养箱内培养，在培养第72h和120h时取细胞液进行细胞计数及计算细胞存活率，然后加入配置好的葡萄糖溶液(SIGMA，储液浓度200mg/L)加入细胞液内，工作浓度为1mg/L；细胞液培养至7天时，取样进行细胞计数及计算存活率，将细胞液以3500r/min的速度进行离心，取上清液进行纯化。

4、纯化；

(1)1L细胞上清液中加入11.688g固体NaCl至浓度为0.2mol/L，12000rpm下离心20min，取上清，离心上清液用0.22μm滤器过滤除菌、除杂质，使样品充分澄清；

(2)Ni Sepharose 6Fast Flow(FF)column捕获，选用GE品牌Ni Sepharose 6Fast Flow(FF)column，规格26mm*20mm，连接上AKTA Purification，正确运行系统；使用5CV的0.2mol/L NaOH冲洗层析系统，浸泡3h进行内毒素灭活，然后用至少10CV去热源水冲洗层析系统至中性；使用5CV的控热源0.2mol/L NiSO4充分冲洗层析系统，以活化层析介质，然后用5CV去热源水冲洗层析系统将游离的NiSO4冲洗干净；使用5CV平衡溶液 1(20mmol/L聚丁烯(PB)、200mmol/L NaCl溶于水，pH 7.4)充分冲洗层析系统，然后将预处理后的样品以5ml/min的流速进行上样，上样完成后再用5CV平衡溶液1充分冲洗层析系统；使用3CV平衡溶液1和洗脱溶液1(20mmol/LPB、200mmol/LNaCl、500mmol/LImidazole溶于水，pH7.4)，采用步级洗脱方式(分三步：E20、E50、E500)纯化目标蛋白，结果如图1所示，泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：上样；泳道3：流穿；泳道4：20mmol/L咪唑洗脱；泳道5：50mmol/L咪唑洗脱；泳道6：500mmol/L咪唑洗脱；泳道7：500mmol/L咪唑洗脱；

(3)取泳道4和泳道5，合并后进行分子筛精细纯化，Superdex200精细纯化，选用GE品牌Superdex 200，规格26mm*600mm，连接上AKTA Purification，正确运行系统；使用3CV的控热源水充分冲洗层析系统，将层析系统冲洗干净；使用3CV平衡缓冲液充分冲洗层析系统，然后将捕获回收的样品以2ml/min的流速进行上样，上样完成后再用3CV平衡缓冲液洗脱；根据纯化图谱接收样品馏分；合并馏分，100倍透析至保存体系(保存溶液:20mmol/L PB、150mmol/L NaCl溶于水，pH7.4)，纯化出的蛋白样品纯度达95％以上，如图2所示，泳道1：还原；泳道2：非还原；泳道3：蛋白质分子量标准。

对上述得到的SLAMF6蛋白活性测定：

PBMC细胞(近岸蛋白)计数，用GT-T551培养基(10％FBS)购于北京同立海源生物公司，调节细胞密度为10*106/ml，向24孔板中加入100μl细胞液。将稀释好的样品加入到24孔板中，最后用GT-T551培养基(10％FBS)将体积补到500μl，37℃，培养3天。收集细胞，850rpm×5min，用GT-T551培养基(10％FBS)调节细胞密度为1×106/ml。包板，用Anti-CD3(近岸蛋白)包板，浓度为5μg/ml，100μl/孔，37℃,培养2h。用PBS(1×)洗板2次，加入第3步处理好的细胞，100μl/孔。37℃过夜孵育。收集上清液，用ELISA试剂盒(博士德生物公司)检测IFN-γ的量。经测定，SLAMF6蛋白具有很好的生物学活性，如图3所示，泳道1：SLAMF6处理的细胞；泳道2：非SLAMF6处理的细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。