SH3结构域非典型配体及其制备方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别是涉及通过肽库技术研究蛋白质相互作用以获得SH3结构域的非典型配体及配体的保守基序。
背景技术：
：SH3结构域在细胞内广泛分布，通常由50～100个氨基酸组成，SH3结构域是一种参与调节多生物过程的重要蛋白质相互作用结构域。最初是在v-Src癌基因酪氨酸激酶产物的同源序列中发现该结构域，现已知SH3结构域在许多信号分子和细胞骨架分子中存在。典型的SH3结构域是由五条β折叠，RTloop，N-Srcloop，thedistalloop和一个310helix组成。SH3结构域在细胞增殖分化的信号通路中发挥作用，被作为不同类型的癌症研究药物靶点。SH3结构域的典型配体，包含-P-x-x-P-序列，加上两端的辅助结合位点形成RXXPXXP，PXXPXR的结合基序。目前SH3结构域在药物发现中的研究主要集中在结构相对单一的典型配体。近年来随着对SH3结构域的深入研究，一些SH3结构域的非典型配体相继被报道发现，例如：RKxxYxxY区域与Fyb，Fyn和Lck蛋白的SH3结构域结合。WxxxFxxLE区域与Pex13p蛋白的SH3结构域结合。这些SH3结构域非典型配体的发现一方面表明SH3结构域的功能存在多样性，另一方面也为以SH3结构域活性为对象的癌症药物靶点研究提供基础和依据。然而，由于SH3结构域典型配体的丰度高、分布广、亲和力强，因此在常规的高通量、大规模筛选过程中，获得的SH3结构域配体绝大多数均为典型配体，很难发现SH3结构域的非典型配体，更难以发现SH3结构域配体的保守基序，因此目前关于SH3结构域非典型配体的报道较少，制约了SH3结构域及其配体的用途。技术实现要素：针对上述现有技术中的不足，本发明提供一种SH3结构域非典型配体及其制备方法。具体而言：本发明提供一种SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征包括以下步骤：步骤一：构建密码子简并的随机肽库；步骤二：构建SH3结构域表达载体，转入宿主细胞；步骤三：肽库选择，获得能够结合SH3结构域的肽；步骤四：序列比对，获得SH3结构域配体的肽基序；步骤五：基序验证，挑选含有所述肽基序的典型阳性肽验证其与SH3结构域的结合能力。本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤一进一步包括：(1)简并密码子和简并反密码子设计：使密码子符合以下通式5’-3’：N1-N2-N3，其中，N1选自A、T、G，N2选自A、T、C、G，N3选自C、G；或N1选自A、T、C、G，N2选自A、T、G，N3选自C、G；使反密码子符合以下通式5’-3’：N3’-N2’-N1’，其中，N3’选自C、G，N2’选自A、T、C，N1’选自A、T、C、G；(2)肽库编码区的人工合成，人工合成以下两条序列序列1：TATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCGGA-(N1-N2-N3)8-TAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAG；序列2：GATCCTACTACTACTACTACTACTACTA-(N3’-N2’-N1’)8-TCCGAATTCACTGGCCTCCATGGCCA(3)将序列1、2退火后插入pGADT7载体的NdeI和BamHI之间，获得上述随机8肽的融合表达载体；(4)将步骤(3)中的表达载体转化感受态大肠杆菌，获得8肽库；(5)对8肽库的容量和重组率进行鉴定，测得库容达到107级以上，重组率达到90％以上，确定为合格。本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤二进一步包括：(1)将SH3结构域序列插入pBridge质粒的EcoRI和BamHI之间，所述SH3结构域选自由hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAb1SH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3组成的组；(2)将表达SH3结构域的重组pBridge质粒转化于酵母感受态细胞中，筛选获得重组酵母菌。本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤三进一步包括：(1)从步骤一获得的随机肽库扩增后，提取并纯化质粒；(2)用步骤二获得的重组酵母制备感受态细胞，用步骤(1)获得的质粒进行转化，抗性筛选阳性克隆；(3)对步骤(2)获得的阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测；(4)β-半乳糖苷酶活阳性的克隆，提质粒、测序；(5)对测序结果进行分析，获得结合SH3结构域的8肽序列。本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤四进一步包括：使用序列分析软件，对步骤三获得的多个8肽序列进行分析比对，获得SH3结构域配体的肽基序。所述的序列分析软件包括DNASTAR、DNAMAN等。本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤五进一步包括：(1)从步骤三获得的阳性8肽序列中选择具有SH3结构域配体肽基序的8肽序列，或人工设计具有步骤四所述配体基序的短肽序列；(2)将所述8肽序列或人工设计的短肽序列插入载体中，使其与SH3结构域在同一个宿主中共表达，验证两者的相互作用。其中，所述人工设计的短肽序列长度为6-20个氨基酸，优选8个氨基酸。本发明还提供一种利用所述方法制备获得的SH3结构域非典型配体。本发明所述SH3结构域非典型配体具有LxLLFF所示的多肽基序，其中x为天然氨基酸。优选，所述SH3结构域非典型配体具有CILWLLFF的氨基酸序列。另外，本发明还提供所述的SH3结构域非典型配体在促进或抑制SH3结构域功能中的用途。本发明取得的技术效果在于：提供了一种简并化肽库的构建和使用方法，成功获得了一系列结构相似的SH3结构域非典型配体，分析出了SH3结构域非典型配体的基序LxLLFF。从而为SH3结构域的作用机理、功能研究、及以构效关系为基础的药物设计等提供依据。附图说明图1：库容测量试验中当稀释度为104时的平板计数情况；图2：肽库选择阳性配体(有两条相同，只显示了9条)的序列比对情况及SH3结构域配体基序分析；图3：WB检测鉴定结果。泳道1为阴性对照组(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空载体)；泳道2为实验组(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-CILWLLFF)。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。所述实施例的内容仅用于说明本发明，并不意味着对本发明的保护范围作出限定。实施例一：肽库的构建1.人工合成序列1、2所示的核酸，退火成双链。1)在0.5ml离心管中配制下列反应液Oligo各取500pmol，在1×AnnealingBuffer中，95度水浴10分钟，自然降温使之复性形成双链，形成粘性末端(NdeI和BamHI)。表1退火反应体系1×AnnealingBuffer20μlOligo500pmolddH20至总体积20μl2)酶切产物用等体积的酚/氯仿抽提一次，10,000rpm离心2min，吸上清于另一管中；3)估计上清的体积，加入1/10体积的NaAc(3M)溶液，然后加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀10min；4)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两遍；5)室温干燥沉淀，然后溶于适量ddH20中。用紫外分光光度计测量所得DNA的浓度与纯度。2.将pGADT7(购自ClontechLaboratoriesInc)在0.5用离心管中限制性内切酶NdeI和BamHI进行双酶切。表2酶切反应体系质粒DNA10-12μl10x酶切buffer2μl内切酶1μlddH20至总体积为20μl于37℃水浴中反应2hr。3.连接表3连接反应体系载体DNA4μl(200ng)InsertDNA2μl(10ng)10x连接buffer2μlT4DNAligase1μl(2U)ddH20至总体积为20μl反应液于16℃水浴，反应过夜。4.大肠杆菌的转化1)以大肠杆菌DH10B株常规方法制备大肠杆菌电感受态细胞；2)取新鲜制备的感受态细胞40μl，加入2-3μl脱盐后连接混合物；3)将40μl细胞转入电转杯中，且使细胞覆盖住电转杯的底部；4)打开电转仪，将电压设在1.8kv；5)将电转杯放入；6)按charge键，直到听见电击声；7)迅速将细胞重悬在1ml的培养基中；8)将细胞在37℃，200rpm摇培60min。取1μl转化菌液用于库容测定，其余则加入甘油至终浓度为20％，于-70℃储存。5.库容测定1)取1μl文库菌液加入100ul新鲜LB液体培养基中，再从中取10ul加入190ul新鲜LB液体培养基，如此进行10倍比梯度稀释，每梯度设三个重复；2)各梯度菌液均匀涂布于LB固体培养基中(Ampr)，37℃倒置过夜；3)计数，对克隆数为10-300的平板进行计数n；4)按下列公式计算文库的容量；5)文库的容量(cfu)＝(n/100μl)×10N(稀释倍数)×1000。在104稀释度平板上，长出了185个克隆(如图1)；105稀释度平板上，长出了21个克隆。经计算库容量约为2×107cfu/mL。6.重组率测定1)在文库容量测定中得到的菌落中随机挑取50个克隆，分别摇菌过夜；2)按小量法提取质粒DNA；3)克隆测序鉴定，计算重组率；4)重组率＝重组子数目/测序菌总数×％。在随机挑取的50个克隆中，经过测序鉴定有两个空载体，计算重组率为96％。实施例二：构建SH3结构域表达载体以分别含有hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAblSH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3编码序列的原始质粒为模板扩增获得九种SH3结构域序列；将其编码序列构建到pBridge载体酶切位点EcoRI、BamHI之间。1.示例性的引物设计如下：2.PCR扩增体系及参数表4.PCR反应体系Componentvol.μlTemplate1Senseprimer1Antisenseprimer110×buffer5dNTPMixture4DNAPolymeraseHiFi1ddH2O37Total50示例性PCR反应参数：以95℃变性10分钟、94℃30秒、59℃30秒、72℃1分钟的条件进行35次循环，最后以72℃延伸10分钟和12℃保存。反应结束取20μlPCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切胶然后高效快速纯化离心柱，13000r/min离心2分钟回收PCR产物。3.酶切、连接、转化的步骤和参数如上所述。4.鉴定挑取长出的大肠杆菌菌落加入2mlLB阳性培养液混匀，放入恒温摇床250rpm过夜，做6个平行样。各取菌液1μl作为模板，PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳，将紫外观测仪下条带大小与引物扩增的预期产物一致。经测序证实9种SH3编码区已成功插入pBridge载体酶切位点EcoRI、BamHI之间。实施例三：肽库选择1.将酵母菌株CG1945，接种固体YPD培养基、及各种营养缺陷型培养基(-Trp、-Leu、-His)中，确定酵母无野生LacZ活性。2.将实施例二中构建的9种重组质粒转化酵母菌。挑取少许酵母菌落加入3mlYPD液体，过夜培养，12000rpm离心弃上清，加入900μlddH20和100μlLiAc溶液混匀，置于30℃水浴5分钟。2000rpm离心弃上清，加入ddH2047μl，1.0MLiAc溶液36μl，50％PEG4000240μl，鲑鱼精DNA5μl，诱饵质粒8μl，使用涡旋振荡仪震摇1分钟，42℃水浴20分钟。之后离心去上清，沉淀加入ddH2050-100μl混匀，涂抹于SD/-Trp固体培养基，30℃培养3天。挑取-Trp培养基上的菌落，加入3ml-Trp液体培养基，放30℃摇床过夜培养。收集菌液，离心弃上清，把沉淀点到滤纸上，放入液氮中反复冻融3分钟，取出后加入5ml新配制Zbuffer/x-Gal溶液湿润滤纸，放入30℃温箱定期观察。挑选8h内不变蓝的重组酵母菌用于肽库选择。3.用实施例1中构建的肽库转化步骤2中的酵母菌。1)挑取步骤2中不变蓝的酵母菌落于0.5mlSD/-Trp液混匀，将混合液转入50mlSD/-Trp液体培养基，30℃摇床培养16-18小时后，加入300mlYPD液体培养基30℃培养3小时。2)1000rpm离心5分钟后将沉淀合并。加入2mlTE/LiAc液混匀。3)加入8mlPEG/LiAc液、文库质粒75μl、鲑鱼精DNA200μl，利用涡旋振荡仪振摇5分钟，30℃摇床培养30分钟，加入1.2mlDMSO。42℃水浴15分钟，冰浴2分钟。4)离心弃上清后加入7ml灭菌水混匀后，将所有液体均匀涂布到20个直径15cm的SD/-Trp-Leu-His固体培养基(含有抑制酵母生长的最小浓度的3AT)上，30℃培养一周。4.挑取SD/-3培养基上的酵母菌落加入3mlSD/-3培养液，试管中混匀30℃摇床过夜培养。每管取1.5ml液体离心弃上清后将沉淀点到滤纸上，放入液氮冻融3分钟，加5ml新配制Zbuffer/x-Gal溶液湿润滤纸，放入30℃温箱，分别于4、8、10、12小时挑取变蓝的克隆。5.将步骤4中培养10小时内变蓝的酵母克隆(阳性克隆)和培养12小时仍未变蓝的酵母克隆(阴性克隆)各挑取10个，提质粒，测序，根据酶切位点的设定，利用DNAclub软件将测序结果中核苷酸序列转化为相应氨基酸序列，即得到AD质粒所编码的SH3结构域配体蛋白的氨基酸序列。配体肽mGadsCSH3的阳性配体序列：02-1VSLVKLFF03-1CIHLPPWF27-3RLWELYFW28-2GWFCLVFF35-1LHLFLLFC36-2LFVNFLCN42-1YGLCLLLF58-2YGLCLLLF50-2LMLCRLLF52-2CILWLLFF其中42-1与58-2两个克隆测序结果翻译出的蛋白相同。mGadsCSH3阴性配体(非配体肽)序列：34-1KFIFFLVR29-1FFLWKLMI64-1DFFVLWYW27-1SYLNKHNW02-3KYRHMVNN11-3FYLYLFCM01-1FLIMVVLH41-2YFFCMCKN01-3VLCVLYVV03-3FZFMLLYV实施例四：序列分析和比对将实施例三中获得的阳性配体序列和阴性配体序列分别用DNAstar软件进行分析，运行MegAlign程序，用CLUSTALw算法进行多重序列比对分析，确定保守区序列。序列分析比对结果如附图所示，其表明SH3结构域配体具有共同的LxLLF基序；阴性配体序列比对后未发现共同的保守基序。实施例五：SH3结构域配体基序LxLLF的验证。以具有LxLLF基序的配体肽52-2为例，进行细胞内试验。1.将mGadsCSH3构建到pEGFP-C3的EcoRI、BamHI之间，引物扩增、酶切、连接的方法参见上文。2.以52-2克隆中携带有CILWLLFF外源肽的质粒为材料，将编码配体CILWLLFF的寡核苷酸构建到p3XFLAG-CMV-14中，扩增后提取纯化获得无内毒素质粒，酶切、连接、转化方法参见上文。3.将步骤1、2获得的两种质粒先后或同时转染HEK293T细胞，获得同时表达上述两种质粒的重组HEK293T(以pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空载体作为阴性对照组)。取HEK293T细胞培养值细胞密度50％左右，更换新鲜的完全培养液，置37℃，5％CO2培养1h。取5-8μgDNA(起始用量5μg)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置。取VigoFect1-4μl(起始用量2μl)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置5分钟。然后将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟。将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2ml培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5％CO2培养。4.将转染后的HEK293T细胞用RIPA细胞裂解液进行裂解，取600μl加入anti-flag抗体(Abmart)3μg，4℃，颠倒混匀4小时；加入预冷的ProteinGagarose30μl，4℃颠倒混匀过夜。用1xIPbuffer洗5次，12000g离心30s，然后0.1xIPbuffer洗一次。12000g离心30s后，彻底去除buffer，加入60μl用60μl上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀。将上样样品95℃煮5分钟，游离抗原，抗体，珠子，离心取上清。5.将上清进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE参数为浓缩胶12％、分离胶8％。电泳结束后进行Western-Blot，将凝胶上的蛋白转到NC膜上，转膜条件：300mA电流恒流转移2-4小时。6.将NC膜用5％脱脂乳封闭后加入anti-GFP孵育过夜，洗膜后加入酶标羊抗GFP二抗孵育2h，洗膜后，加显色剂显色。WB结果显示，转染了pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-CILWLLFF的重组酵母裂解液中以anti-flag抗体能够沉淀出蛋白，并且其沉淀获得的多肽用WB检测GFP呈阳性。而转染了pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空载体的重组酵母裂解液中，以anti-flag抗体沉淀出的蛋白用WB检测不含GFP(结果如附图3所示)。上述结果证实，当CILWLLFF、mGadsCSH3在真核动物细胞中表达时，二者能相互结合形成复合物。另外，采用35-1重复实施例五也取得了相似的结果。上述实施例中的内容仅用于说明本发明，并不以任何方式对本发明的保护范围作出限定。在实际应用中，本领域技术人员根据本发明的构思和精神，以本发明为基础做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3