本发明涉及生物
技术领域：
中rs1042658在预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险中的应用。
背景技术：
：发热伴血小板减少综合征是在我国农村地区首次被发现的一种新发传染病。病原体是布尼亚病毒科白蛉病毒属中的一种新型病毒，名为新布尼亚病毒。被该病毒感染后，经过机体自身的免疫反应，仍然有大约12％的感染者发病且出现广泛的临床症状谱，甚至可能导致死亡，提示个体的遗传因素在该病的发生起重要作用。鉴定新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡的易感基因有助于预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡的个体风险和群体风险，且有助于阐明与此疾病相关的发病机制。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是一种重要的造血生长因子，对人体外周血粒细胞数量和功能维持起着十分关键作用。目前已经有关于G-CSF与外周血粒细胞的关系及其与一些疾病的相关性已有较多的研究报导。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是存在于某一(些)群体、正常个体的基因组DNA中单碱基的序列差异，是继限制性酶切长度多态性和微卫星之后的第三代遗传标记。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险。为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述任一用途：A1)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在制备预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险产品中的应用；A2)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在制备筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征高死亡风险患者产品中的应用；A3)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在制备检测与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；A4)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；B1)人基因组中rs1042658的多态性或基因型在制备预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡风险产品中的应用；B2)人基因组中rs1042658的多态性或基因型在制备筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征高死亡风险患者产品中的应用；B3)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险中的应用；B4)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征高死亡风险患者中的应用；B5)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在检测与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险相关的单核苷酸多态性的中的应用；B6)检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险相关的单核苷酸多态性的中的应用；B7)人基因组中rs1042658的多态性或基因型在预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡风险中的应用；B8)人基因组中rs1042658的多态性或基因型在筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征高死亡风险患者中的应用。rs1042658是人染色体上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(C/T，在其互补链上则为G/A)。所述rs1042658基因型是CC、CT或TT。所述CC是rs1042658位点为C的纯合型，所述TT是rs1042658位点为T的纯合型，所述CT是rs1042658位点为C和T的杂合型。所述检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型具体可通过检测rs1042658的核苷酸种类确定。上述用途中，所述检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质可为扩增包括rs1042658在内的基因组DNA片段的PCR引物和/或单碱基延伸引物。上述用途中，所述C/T和T/T基因型的个体在新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡群体中的比例低于其在新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者非死亡群体中的比例。上述用途中，所述新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征可为中国人群新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征。为解决上述技术问题，本发明还提供了含有检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质的产品。本发明所提供的含有检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质的产品，为a)-d)中的任一种产品：a)检测与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；b)鉴定或辅助鉴定与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡风险相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；c)筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征高死亡风险患者产品；d)预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡风险产品。上述产品中，所述检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质可为扩增包括rs1042658在内的基因组DNA片段的PCR引物和/或单碱基延伸引物。上述产品中，所述新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征可为中国人群新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1)或M2)的方法：M1)预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险的方法，包括：检测待测对象基因组中rs1042658位点的基因型，rs1042658位点为CC基因型待测对象新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征的死亡风险分别高于或候选高于rs1042658位点为CT基因型和TT基因型的待测对象；M2)筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征高死亡风险患者的方法，包括：检测待测对象基因组中rs1042658位点的基因型，rs1042658位点为CC基因型的待测对象为或候选为新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征高死亡风险患者；rs1042658位点为CT基因型的待测对象为或候选为新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征低死亡风险患者；rs1042658位点为TT基因型的待测对象为或候选为新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征低死亡风险患者。上述方法中，检测待测对象基因组中rs1042658位点的基因型可采用所述检测rs1042658的多态性或基因型的物质进行。上述方法中，所述新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征可为中国人群新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征。本发明中，所述PCR引物可为P1和P2；所述P1是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：a1)序列表中SEQIDNo.1所示的单链DNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述P2可为如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：b1)序列表中SEQIDNo.2所示的单链DNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。所述单碱基延伸引物可为如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：c1)序列表中SEQIDNo.3所示的单链DNA；c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在SEQIDNo.1所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在SEQIDNo.2所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在SEQIDNo.3所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。实验证明，在新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者群体中，rs1042658的T等位在死亡病例组中的比例低于其在非死亡病例组中的比例，具有统计学差异，说明rs1042658的T等位为新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡的保护等位；rs1042658的C等位在死亡病例组中的比例高于其在非死亡病例组中的比例，具有统计学差异，说明C等位为风险等位新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡的风险等位。在新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者群体中，rs1042658位点的三个基因型中，C/T和T/T基因型的个体在死亡病例组中的比例低于其在非死亡病例组中的比例，C/C基因型的个体在死亡病例组中的比例高于其在非死亡病例组中的比例。在新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者群体中，与携带C/C基因型的个体相比，携带C/T和T/T基因型的个体发热伴血小板减少综合征死亡风险减少，比值比(Oddsratio，OR)为0.46，P＝0.018，说明rs1042658多态性位点与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险的发生显著关联。在实际应用中，可将检测rs1042658的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与中国人新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备预测中国人新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡风险的产品。其中，检测人基因组中rs1042658的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs1042658的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技术和SequenomMassArray技术。其中，利用SequenomMassArray技术确定rs1042658的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶(如虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase，SAP))、树脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)以及SequenomMassArray技术所需要的其他试剂和仪器；利用TaqMan探针技术确定rs1042658的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的软件(如7500SystemSDSsoftware)以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂；SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由引物和DNA测序仪组成的系统，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统，由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的软件以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统，由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪和进行基因分型的软件以及SequenomMassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。本发明的一个实施例中，采用SequenomMassArray技术确定rs1042658的多态性和基因型。所述PCR引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs1042658在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的单链DNA。所述单碱基延伸引物具体可为序列表中SEQIDNo.3所示的单链DNA。SequenomMassArray技术所需要的其他仪器为MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪(SEQUENOM公司)。SequenomMassArray技术所需要的芯片为SpectroCHIP(Sequenom)芯片。所述进行基因分型的软件具体为MALDI-TOF和TYPER4.0软件(sequenom)。本发明在一个来自中国人群的样本(新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者非死亡群体和新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡群体)中发现rs1042658是与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡风险高低相关的单核苷酸多态性。可将检测rs1042658的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡风险相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备预测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者死亡风险的产品。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1检测G-CSF基因的rs1042658位点基因型方法的建立1、基因组DNA的提取提取待测样品基因组DNA，以其为模板进行基因型检测。2、引物的设计与合成使用Sequenom公司GenotypingTools及MassARRAYAssayDesign软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。检测G-CSF基因的rs1042658基因型的特异性引物对的序列为：正向引物(其名称为P1)5’-ACGTTGGATGATTCCTCCTGTCTGCTCCCT-3’(序列表中的SEQIDNo.1)；反向引物(其名称为P2)5’-ACGTTGGATGGTGACTCTTTTTAGGGCCAG-3’(序列表中的SEQIDNo.2)。用于单碱基扩增反应的延伸引物序列为5’-gggtACATTTGCCTTGCTGGA-3’(序列表中的SEQIDNo.3)。3、检测G-CSF基因的rs1042658位点基因型方法的建立3.1PCR扩增：PCR扩增在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μL，按表1配制PCR反应体系。表1每个PCR反应体系的组分PCR反应程序为：94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。3.2PCR产物碱性磷酸酶处理：在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs，按表2配制SAP反应体系。表2SAP反应体系试剂体积(μL)超纯水1.5310×SAP缓冲液0.17SAP酶(1.7U/μl)0.3总体积2反应条件为：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持。3.3单碱基延伸：在碱性磷酸酶处理结束后利用10×单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应酶(1.7U/μl)和SEQIDNo.3所示的单碱基扩增反应的延伸引物进行单碱基延伸反应。反应条件为：I.94℃30秒II.94℃5秒III.52℃5秒IV.80℃5秒V.回到III，4次循环VI.回到II，39次循环VII.72℃3分钟VII.4℃3.4树脂纯化：将CleanResin树脂平铺到6mg的树脂板中；加16μl水到延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触；离心使树脂沉入孔底部。3.5芯片点样：启动MassARRAYNanodispenserRS1000点样仪(SEQUENOM公司)，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片(SEQUENOM公司)上。3.6质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果。实施例2G-CSF基因的rs1042658位点与中国人新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡易感性的分析用实施例1建立起来的方法，对中国人群(430例新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者)的G-CSF基因的rs1042658位点基因型进行了分析。1、研究对象病例组：430例新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者，且均符合新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者临床诊断标准并经过新布尼亚病毒核酸检测确认。其中48人死亡。将未死亡的382例患者归为非死亡病例组，将死亡的48例患者归为死亡病例组。所有研究对象均为无血缘关系的中国汉族人。所有研究对象均签署了知情同意书，通过结构化的问卷来收集个人的人口统计学资料和病史。本研究得到解放军154医院伦理委员会的批准。2、G-CSF基因的rs1042658位点基因型的确定人群中G-CSF基因的rs1042658位点的基因型和等位的频率分布如表3所示。结果显示，在所有的研究对象中，非死亡病例组中C等位的频率为55.5％，T等位的频率为44.5％；死亡病例组中C等位的频率为67.7％，T等位的频率为32.3％。T等位在死亡病例组中的频率比在非死亡病例组中的频率低，具有统计学差异，表明rs1042658位点的T等位为中国人新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡的保护等位，而rs1042658的C等位在死亡病例组中的比例高于其在非死亡病例组中的比例，具有统计学差异，说明C等位为中国人新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡的风险等位。在所有的研究对象rs1042658位点的三个基因型中，C/C基因型的个体在死亡病例组中的比例高于其在非死亡病例组中的比例，C/T和T/T的个体在死亡病例组中的比例分别低于相应基因型的个体在非死亡病例组中的比例。在所有的研究对象中，与携带C/C基因型的个体相比，携带C/T和T/T基因型的个体新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡发生风险降低，OR值为0.46[95％置信区间(95％CI)＝(0.24-0.87)；P＝0.018]。结果表明，可以利用rs1042658位点预测中国人新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者的死亡风险。表3G-CSF基因的rs1042658位点与中国人新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征死亡的关联分析注：OR，比值比(oddsratio)；CI，置信区间(confidenceinterval)。a数据经过logistic回归分析，并进行了年龄、性别和基础疾病的校正。bχ2检验。当前第1页1 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