高稳定的纳米金探针功能复合物及其制备方法与流程

本发明属于分子生物技术和生物检测领域，涉及到一种高稳定的纳米金探针功能复合物及其制备。

背景技术：

目前纳米金探针功能复合物已经应用于多种领域，如纳米金探针复合物已经在多种诊断技术中作为指示剂使用，但是由于纳米金探针复合物本身能够检测的目标核酸灵敏度有限，使之在直接检测真实标本时受到限制。为能够采用纳米金探针复合物作为指示剂检测真实标本，常需要与一些酶扩增方法相偶联以增加检测灵敏度，但由于目前的纳米金探针复合物稳定性差，不能耐受酶扩增过程的热循环，且会抑制酶扩增反应，导致纳米金探针复合物只能在酶扩增反应结束后加入反应体系中指示其结果，这种方式不仅操作复杂，还增加了酶扩增反应产物交叉污染的风险，不能满足真实标本的检测。

因此本领域需要开发一种能够与酶扩增反应同时存在且不影响其性能的新型纳米金探针功能复合物及其制备方法，使之通过简单操作就能使纳米金与功能分子相连接，并能够达到耐受酶扩增热程序和对酶扩增反应零抑制的效果，从而有效提高纳米金功能复合物在生物领域的实用性。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有纳米金探针功能复合物的上述不足，提供一种新的纳米金功能复合物，该纳米金功能复合物具有很好的稳定性，能够耐受强热循环和强机械冲击；具备强适用性，能够与各种酶反应液共存而不影响反应的正常进行。

实现上述目的的技术方案如下。

一种纳米金探针功能复合物，其由纳米金颗粒、连接于纳米金颗粒表面的功能核酸探针以及稳定剂构成，所述稳定剂为含有巯基基团的有机分子；稳定剂是通过其巯基基团与纳米金颗粒连接；

所述功能核酸探针具有以下结构：

HS-(M)m-Q；

HS为巯基基团；M为亚甲基、乙二醇基及其衍生物，m为1-18的整数；Q为核苷酸序列。

在其中一个实施例中，所述含有巯基基团的有机分子选自半胱氨酸、巯基乙醇、12-巯基十二酸、巯基甲氧基硅烷。

在其中一个实施例中，所述核苷酸序列的长度为10-50个碱基。

在其中一个实施例中，所述m为3-8的整数。

在其中一个实施例中，所述纳米金颗粒的平均尺寸可以为5nm-50nm。

本发明所述一种耐热且能够与核酸扩增酶反应共存的纳米金探针功能复合物由纳米金颗粒和功能核酸探针、稳定剂如巯基甲氧基硅烷在缓冲液中连接构成，核酸探针及稳定剂均是通过巯基基团与纳米金颗粒相连接构成纳米金探针功能复合物。

本发明的另一目的是提供上述高稳定的纳米金探针功能复合物的制备方法，该制备方法的过程相对简单，制备方式比较灵活。

实现上述目的的技术方案如下。

上述纳米金探针功能复合物的制备方法，包括以下步骤：

(S1)先将纳米金颗粒与功能核酸探针按1:300-1000混合；

(S2)加入氟表面活性剂，再加入缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育，离心洗涤后重悬于缓冲液；

(S3)加入稳定剂，室温杂交孵育24h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中。

在其中一个实施例中，(S2)中室温杂交孵育，(S3)室温杂交孵育20-30h。

在其中一个实施例中，所述氟表面活性剂为FS-10、FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述缓冲液可以为常规的磷酸盐缓冲液、Tris盐缓冲液、MOPS盐缓冲液。

在其中一个实施例中，纳米金颗粒与功能核酸探针按优选1:400-800混合。

所述的高稳定耐热且能够与核酸扩增酶反应共存的新型纳米金探针功能复合物制备方法，先通过纳米金颗粒与待连接探针在含有表面活性剂的缓冲液条件下孵育实现纳米金与待连接探针快速连接，再通过与含巯基稳定剂孵育使纳米金与含巯基稳定剂相连接，从而制备能够高稳定耐热且能够与酶反应共存的新型纳米金探针功能复合物。

所述的新型纳米金探针复合物能够用于闭管核酸扩增产物的检测，而同时纳米金探针功能复合物的存在不会影响核酸扩增等酶反应。

所述的高稳定耐热且能够与酶反应共存的新型纳米金探针功能复合物，在高温至90℃以上其功能能够不受影响，且能够直接应用于基于酶反应的检测实验或其他实验中而不影响酶反应或其他反应的正常进行。

本发明采用的纳米金探针有比较成熟的方法合成，成本低；而所述纳米金探针功能复合物具备高稳定性，能够耐受强热循环和强机械冲击；具备强适用性，能够与各种酶反应液共存而不影响反应的正常进行。

本发明所述的高稳定的纳米金功能复合物，如纳米金探针复合物进行核酸检测时，可实现短时间高灵敏度的闭管核酸检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。且本发明的纳米金功能复合物制备，其过程相对简单，制备方式相对灵活。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，不用于限定有权利要求所界定的本发明范围。

图1是纳米金探针功能复合物结构示意图。

图2是实施例1中制备的纳米金探针功能复合物分别于不同的温度下孵育稳定性结果。

图3是实施例2中纳米金探针功能复合物制备中表面活性剂选择结果。

图4是实施例3中纳米金探针功能复合物制备中缓冲液类型选择结果。

图5为实施例4中纳米金探针功能复合物的连接区M种类(M1和M2)选择结果。

图6为实施例5中纳米金探针功能复合物的连接区M基本单位个数选择结果。

图7为实施例6中纳米金探针功能复合物制备中不同长度探针的制备结果。

图8是实施例7中本发明中纳米金探针功能复合物对PCR扩增的影响结果。

图9是实施例8中关于所述纳米金探针功能复合物经历PCR热循环前后对其稳定性的影响，经历PCR热循环前后，所述纳米金探针功能复合物稳定性未受到影响。

图10是实施例9关于所述纳米金探针功能复合物用于指示核酸侵入信号反应结果，与核酸侵入信号反应同时存在而不会影响核酸侵入信号反应的正常进行，所述的纳米金探针功能复合物能够与核酸侵入信号反应共存。

图11是实施例10关于所述纳米金探针功能复合物用于指示聚合酶链式反应和核酸侵入信号反应结果。

具体实施方式

本实施例涉及一种高稳定的纳米金探针功能复合物，其有纳米金颗粒、连接于纳米金颗粒表面的功能核酸探针以及稳定剂构成，所述稳定剂为含有巯基基团的有机分子，稳定剂是通过其巯基基团与纳米金颗粒连接；

所述功能核酸探针具有以下结构：

a：HS-(M)m-Q，

其中，HS为巯基基团；(M)m为连接区；

(I)功能核酸探针(a)结构中M可以为亚甲基、乙二醇基及其衍生物；

(II)功能核酸探针(a)结构中(M)m，m为选自1-18的整数；m更优选为3-8的整数；

(III)功能核酸探针(a)结构中Q，可以为不同碱基组成和长度的核苷酸序列。该核苷酸序列的长度对于高稳定纳米金探针功能复合物而言并无限制，根据具体的检测需求，适应设计即可。通常其长度为10-50个碱基。

所述纳米金颗粒市面上能够购买得到的合格产品即可，通常，其平均尺寸可以为5nm-50nm。

如图1所示，本发明其中一个实施例所述的高稳定纳米金探针功能复合物包括有：含有巯基基团、连接区、核酸探针，核酸探针通过巯基基团与纳米金颗粒相连接；含巯基稳定剂同样通过巯基基团与纳米金颗粒相连接。

本实施例所述的新型纳米金探针功能复合物由纳米金颗粒和功能核酸探针、稳定剂如巯基甲氧基硅烷在氟表面活性剂、缓冲液中制备得到，核酸探针及稳定剂均是通过巯基基团与纳米金颗粒相连接构成纳米金探针功能复合物。

本实施例还涉及所述高稳定纳米金探针功能复合物的制备方法，包括以下步骤：

(S1)先将纳米金颗粒与功能核酸探针按1:300-1000混合；

(S2)加入氟表面活性剂，再加入缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育2-10h，离心洗涤后重悬于缓冲液；其中，所述氟表面活性剂为FS-10、FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100中的至少一种；所述缓冲液可以为常规的磷酸盐缓冲液、Tris盐缓冲液、MOPS盐缓冲液；

(S3)加入稳定剂，室温杂交孵育20-30h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

以下实施例中所用到的FS-10、FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100购自于杜邦。

实施例1

首先将纳米金颗粒与含巯基探针(探针1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.1)以一定比例混合(如以1:400)，加入含巯基表面活性剂如FSN-100，并加入pH 6.0的磷酸钾缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育3h，离心洗涤后重悬于磷酸钾缓冲液，加入含巯基稳定剂如巯基甲氧基硅烷，室温杂交孵育24h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中备用。制备结束的纳米金探针复合物分别于Tris缓冲液条件下孵育在60℃、80℃、90℃、95℃条件下40分钟后，计算纳米金颗粒表面尚存留的核酸百分数(纳米金颗粒表面核酸总数采用DTT洗脱计算，为100％)。

图2为将制备的纳米金探针功能复合物分别于不同的温度下孵育稳定性结果，结果显示，本方法制备的纳米金探针能够在高温条件下保持绝大多数探针不脱落，显示了本发明所述方法制备的纳米金探针复合物具备高稳定性。

实施例2

首先将纳米金颗粒与含巯基探针(探针1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.1)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性剂如FSN-100，表面活性剂分别选择FS-30、FS-31、FS-3100、FS-50、FSN-100进行比较，并加入磷酸钾缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育3h，离心洗涤后重悬于磷酸钾缓冲液，加入含巯基稳定剂如巯基甲氧基硅烷，室温杂交孵育24h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中备用。制备结束的纳米金探针复合物分别采用DTT处理计算修饰探针数。

图3为纳米金探针功能复合物制备中表面活性剂选择结果，结果显示，本方法采用不同表面活性剂制备的纳米金探针复合物修饰的探针数基本一致，不存在显著性差异。

实施例3

首先将纳米金颗粒与含巯基探针(探针1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.1)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性剂如FSN-100，并加入磷酸钾缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育3h，离心洗涤后重悬于缓冲液，加入含巯基稳定剂如巯基甲氧基硅烷，室温杂交孵育24h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中备用。缓冲液分别选择磷酸钾缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液。制备结束的纳米金探针复合物分别采用DTT处理计算修饰探针数。

图4为纳米金探针功能复合物制备中缓冲液类型选择结果，结果显示，本方法采用不同缓冲液类型制备的纳米金探针复合物修饰的探针数基本一致，不存在显著性差异。

实施例4

分别取不同的含巯基探针，连接区M种类分别为亚甲基(M1)、乙二醇基(M2)，分别将纳米金与含巯基探针(探针1序列：SH-(CH₂)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探针2序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性剂如FSN-100，并加入磷酸钾缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育3h，离心洗涤后重悬于缓冲液，加入含巯基稳定剂如巯基甲氧基硅烷，室温杂交孵育24h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中备用。制备结束的纳米金探针复合物分别采用DTT处理计算修饰探针数。

图5为纳米金探针功能复合物连接区M种类(M1和M2)选择结果，结果显示，本方法采用不同连接区M种类制备的纳米金探针复合物基本一致，不存在显著性差异。

实施例5

分别取不同的含巯基探针，连接区M分别为3、6、12、18个乙二醇基基团，分别将纳米金与含巯基探针(探针1序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探针2序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探针3序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₁₂-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM；探针4序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₁₈-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM)以一定比例混合(如以1:400)，加入表面活性剂如FSN-100，并加入磷酸钾缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育3h，离心洗涤后重悬于缓冲液，加入含巯基稳定剂如巯基甲氧基硅烷，室温杂交孵育24h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中备用。制备结束的纳米金探针复合物分别采用DTT处理计算修饰探针数。

图6为纳米金探针功能复合物连接区M数目的选择结果，结果显示，本方法采用不同连接区M不同数目乙二醇基基团的纳米金探针复合物基本一致，不存在显著性差异。图中横坐标3、6、12、18分别为乙二醇基的个数。

实施例6

分别制备长度为15bp、25bp、35bp、45bp的含巯基探针，分别为探针a(探针2序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT-FAM，SEQ ID NO.2)、探针b(探针3序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT T-FAM，SEQ ID NO.3)、探针c(探针4序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT TAT TGG AAT TG-FAM，SEQ ID NO.4)、探针d(探针5序列：SH-(CH₂O-CH₂O)₃-AGC TGA AAT AAT GAT TAT CAA TAT TAT TGG AAT TGA TGG AAT TGT-FAM，SEQ ID NO.5)。将纳米金与含巯基探针以1:400比例混，加入FS-50表面活性剂，并加入磷酸钾缓冲液和氯化钠溶液混合均匀，室温杂交孵育3h，离心洗涤后重悬于缓冲液，加入含巯基稳定剂如巯基甲氧基硅烷，室温杂交孵育24h，结束后离心洗涤重悬于无离子水中备用。制备结束的纳米金探针复合物分别于Tris缓冲液条件下孵育在90℃条件下40分钟后，计算纳米金颗粒表面尚存留的核酸百分数(纳米金颗粒表面核酸总数采用DTT洗脱计算，为100％)。

图7为纳米金探针功能复合物制备中不同长度探针的制备结果，结果显示，本方法采用不同长度探针均可制备成功纳米金探针复合物。图中a，b，c，d组分别对应探针a，探针b，探针c，探针d。

实施例7

该反应体系组成为10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物1(序列为：5’-TGC ATG GTA TTC TTT CTC TTC CGC ACC-3’，SEQ ID NO.6)，1μM引物2(序列为：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC-3’，SEQ ID NO.7)，加入纳米金探针功能复合物(探针序列：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₃-SH，SEQ ID NO.8)，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入100pM、20pM、4pM、0.8pM、0.16pM及0pM的待测核酸(序列为：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC AGC ATG TCA AGA TCA CAG ATT TTG GGC GGG CCA AAC TGC TGG GTG CGG AAG AGA AAG AAT ACC ATG CA -3’，SEQ ID NO.9)，与不加入纳米金探针功能复合物的反应进行对比，各管反应总体积均为20μL，反应程序为：94℃，2min；94℃，10s，72℃，40s，30循环；72℃，10min；10℃，2min。

反应结束后进行电泳，结果示于图8中。图8的结果显示本发明所述的纳米金探针功能复合物不会影响PCR扩增反应的正常发生。

实施例8

该反应体系组成为10mM Tris缓冲液(pH 8.5)中加入两种修饰的纳米金探针功能复合物(探针序列1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₆-SH，SEQ ID NO.8；探针序列2：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AAA AAA AAA AAT GAT TAT CAA TAT T，SEQ ID NO.10)各4μL，0.2μM杂交探针(序列为：5’-GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT-3’，SEQ ID NO.11，各管反应总体积均为20μL，反应程序为：94℃，2min；94℃，10s，72℃，40s，30循环；72℃，10min；94℃，5s；55℃，30min；4℃，2min。

反应结果示于图9。图9的结果显示，所述的纳米金探针功能复合物经历PCR热循环前后所述纳米金探针功能复合物稳定性未受到影响。

实施例9

该反应体系组成为10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，0.2μM上游探针(序列为：5’-CTC TGC CAC CAG CTC CCA -3’，SEQ ID NO.12)，0.2μM下游探针(野生型探针序列为：5’-CGC GCC GAG GCG AAC TTG GGC GAG-3’，SEQ ID NO.13)，0.2μM杂交探针(序列为：5’-GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT-3’，SEQ ID NO.11)，加入纳米金探针功能复合物(探针序列1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₆-SH，SEQ ID NO.8；探针序列2：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AAA AAA AAA AAT GAT TAT CAA TAT T，SEQ ID NO.10)，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入100pM、20pM、4pM、0.8pM、0.16pM及0pM的待测核酸(序列为：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC AGC ATG TCA AGA TCA CAG ATT TTG GGC GGG CCA AAC TGC TGG GTG CGG AAG AGA AAG AAT ACC ATG CA-3’，SEQ ID NO.6)，各管反应总体积均为20μL，反应程序为：94℃，1min；63℃，40min；55℃，30min；4℃，2min。

反应结果示于图10。图10的结果显示，与核酸侵入信号反应同时存在而不会影响核酸侵入信号反应的正常进行，即所述的纳米金探针功能复合物能够与核酸侵入信号反应共存。

实施例10

该反应体系组成为10mM Tris缓冲液(pH 8.5)，1μM引物1(序列为：5’-TGC ATG GTA TTC TTT CTC TTC CGC ACC-3’，SEQ ID NO.6)，1μM引物2(序列为：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC-3’，SEQ ID NO.7)，0.2μM上游探针(序列为：5’-CTC TGC CAC CAG CTC CCA-3’，SEQ ID NO.12)，0.2μM下游探针(野生型探针序列为：5’-CGC GCC GAG GCG AAC TTG GGC GAG-3’，SEQ ID NO.13)，0.2μM杂交探针(序列为：5’-GTC TTG TGG TAC TGC ACT CGT CTC GGT TTT CCG AGA CGA GTC CTC GGC GCG ATC GTG ATG AAC CAT-3’，SEQ ID NO.11)，加入纳米金探针功能复合物(探针序列1：GCA GTA CCA CAA GAC AAA AAA AAA A-(CH₂O-CH₂O)₆-SH，SEQ ID NO.8；探针序列2：SH-(CH₂O-CH₂O)₆-AAA AAA AAA AAT GAT TAT CAA TAT T，SEQ ID NO.10)，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，向该体系中分别加入5fM、500aM、50aM、5aM、2.5aM、500zM、50zM及0zM的待测核酸(序列为：5’-GGA ACG TAC TGG TGA AAA CAC CGC AGC ATG TCA AGA TCA CAG ATT TTG GGC GGG CCA AAC TGC TGG GTG CGG AAG AGA AAG AAT ACC ATG CA-3’，SEQ ID NO.9)，各管反应总体积均为20μL，反应程序为：94℃，2min；94℃，10s，72℃，40s，36循环；94℃，5s；63℃，40min；55℃，30min；4℃，2min。

反应结果示于图11。图11的结果显示，与聚合酶链式反应和核酸侵入信号反应同时存在而不会影响聚合酶链式反应和核酸侵入信号反应的正常进行，即本发明中的纳米金探针功能复合物能够与聚合酶链式反应和核酸侵入信号反应共存。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。