一种高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌筛选方法与流程

本发明涉及微生物及发酵领域，具体的涉及一株高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌筛选方法。

背景技术：

豆粕因其较高的蛋白含量、平衡的氨基酸配比，被广泛应用于食品与饲料行业。而生大豆中含有大量的抗营养因子，比如胰蛋白酶抑制因子、凝集素、抗原蛋白、植酸以及非淀粉多糖。其中主要的抗原蛋白为大球蛋白和β-伴球蛋白。经过多年的研究及验证，微生物发酵对降解豆粕中的抗营养因子以及改善养殖效果作用明显。近期利用芽孢杆菌固态发酵生产的发酵豆粕被引入了亚洲及美国市场。

发酵菌株的筛选决定了产品的品质及生产效率。由于能够分泌高效的蛋白酶，芽孢杆菌成为常用的豆粕抗原蛋白降解菌株。目前，对于芽孢杆菌的筛选常规的方法为酪素蛋白平板法、纤溶蛋白平板法、脱脂乳平板法。不过这三种方法的筛选多用于筛选高产蛋白酶的菌株，而非用于筛选特异性降解豆粕抗原蛋白的菌株。

技术实现要素：

针对如何筛选高效降解豆粕抗原蛋白的益生型芽孢杆菌的问题，本发明提供了一种高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌筛选方法。

一种高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌筛选方法，包括如下步骤，从腌菜中筛选出的芽孢杆菌，点种于抗原蛋白筛选平板表面，培养24小时，根据抗原蛋白筛选平板的水解圈大小及菌株直径比选择用于豆粕抗原蛋白降解的菌株；所述的抗原蛋白筛选平板采用双层培养基铺板，上层培养基为营养培养基，下层培养基为选择性培养基，其中下层培养基的制备过程主要采用等电点沉降法，从豆粕浸出液中沉降出抗原蛋白大球蛋白沉淀和β-伴球蛋白，溶于ddH2O得到抗原蛋白水溶液后，加入琼脂后铺板。

所述的下层培养基的制备过程具体如下：称取5g豆粕，磨碎后过60目筛加入75mL pH 8.5的 Tris-HCl缓冲液，30~50℃ 200rpm 振荡1h，9000g离心10~40 min，得到上清和沉淀，取沉淀再浸提一次，合并上清液，向上清液中加入0.01M Na₂SO₃，用2M HCl 调pH至6.4，4℃沉淀过夜，于6500 g，4℃，离心10~30 min，得到大球蛋白沉淀，沉淀后的上清液加NaCl至0.25M，调pH至4.0~6.0，室温搅拌30 min； 9000g 4℃，离心30min，离心后的上清液稀释2倍，调pH至4.8，6500g, 20min 离心得到β-伴球蛋白沉淀，将大球蛋白沉淀和β-伴球蛋白沉淀溶于ddH2O，调pH至5.5~6.5，得到抗原蛋白水溶液，加入1.5%（w/v）的琼脂，115℃ 20min灭菌。

所述的上层培养基配方如下：牛肉膏 0.3%（w/v）， 葡萄糖3%（w/v）， 蛋白胨10%（w/v），NaCl 5%（w/v），加入1.5~1.8%（w/v）琼脂，115℃灭菌20min。

所述的从腌菜中筛选出的芽孢杆菌的步骤如下：取1g生腌菜样本，加入15mL 生理盐水，水浴加热至65℃，并孵育10min，孵育结束后，将样本液体混匀，稀释10倍，取50µＬ涂布于LB平板上，37℃培养12小时，得到芽孢杆菌菌斑。

本发明的有益效果

相比较传统的筛选方法酪素蛋白平板法、纤维蛋白平板法、脱脂乳平板法本方法以豆粕抗原蛋白为主要的筛选基质。

在筛选基质基础上，相较于单层平板法，采用双层平板法，能够更直观比较菌体分泌蛋白酶的能力及蛋白酶的活力。

通过比较菌落大小、蛋白层水解圈大小可以从菌株生长水平、降解能力大小，综合筛选需要的菌株。

该方法筛选的菌株相较于普通高产蛋白酶菌株，对豆粕抗原蛋白降解率更高。

附图说明

图1是抗原蛋白平板筛选结果图；

图2是SDS-PAGE检测所筛选菌株的抗原蛋白降解能力比较图。

具体实施方式

一种芽孢杆菌筛选的方法：

取1g左右的生腌菜样本，加入15mL 生理盐水，水浴加热至65℃，并孵育10min。孵育结束后，将样本液体温和混匀，稀释10倍，取50µＬ涂布于LB平板上。37℃培养12小时后，可见芽孢杆菌菌斑形成。

一种营养培养基平板制作方法：

培养基配方：牛肉膏 0.3%（w/v）， 葡萄糖3%（w/v）， 蛋白胨10%（w/v）， NaCl 5%（w/v），加入1.5~1.8%（w/v）琼脂，115℃灭菌20mins。

一种抗原蛋白筛选培养基的制备方法：

称取5g豆粕，磨碎后过60目筛加入75mL pH 8.5的 Tris-HCl缓冲液，30~50℃ 200rpm 振荡1h，9000g离心10~40 min。得到上清和沉淀。取沉淀再浸提一次，合并两次的上清液。向上清液中加入0.01M Na₂SO₃，用2M HCl 调pH至6.4，4℃沉淀过夜。于6500 g，4℃，离心10~30 min，得到大球蛋白沉淀。上清液加NaCl至0.25M，调pH至4.0~6.0，室温搅拌30 min； 9000g4℃，离心30min，上清液稀释2倍，调pH至4.8， 6500g, 20min 离心得到β-伴球蛋白沉淀。将所有沉淀溶于ddH2O，调pH至5.5~6.5。得到抗原蛋白水溶液。加入1.5%（w/v）的琼脂，115℃20min灭菌。

一种抗原蛋白筛选平板的制备方法：

先在9mm灭菌培养皿中加入15mL的抗原蛋白培养基，待冷却后，每块筛选平皿加入15mL营养培养基，冷却至凝固，待培养基表面无明显水迹后，存于4℃备用。

一种筛选高效降解豆粕抗原蛋白芽孢杆菌的方法：

将从腌菜中筛选出的芽孢杆菌点种于抗原蛋白筛选平板表面，培养24小时后，若菌株对抗原蛋白有降解作用，即可见到水解圈。根据水解圈大小及菌株直径比可以选择合适的菌株用于豆粕抗原蛋白降解。

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。

仪器与试剂

9mL玻璃平皿，移液枪，灭菌锅。试剂：生理盐水（也可换用0.01M pH7.4的PBS），pH 8.5的 Tris-HCl缓冲液，0.01M Na₂SO₃溶液，2M HCl，双蒸水，氯化钠（分析纯），营养培养基，LB培养基。

实施例1 高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3的筛选

取1g左右的生腌菜样本，加入15mL 生理盐水，水浴加热至65℃，并孵育10min。孵育结束后，将样本液体温和混匀，稀释10倍，取50µＬ涂布于LB平板上。选取芽孢杆菌，经三次划线纯化后，于LB液体培养基中培养12小时。吸取1uL培养液点种于抗原蛋白筛选平板表面。24小时后即可得到结果图1。

实施例2 芽孢杆菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3豆粕发酵验证

将筛选出的菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3分别在LB液体培养基中培养过夜，菌液OD达到1.0左右，按5%接种量接种入含水量50%的豆粕。37℃发酵24小时。以SDS-PAGE及ELISA试剂盒检测发酵豆粕中大球蛋白及β-伴球蛋白含量，验证筛选效果如图2、表1所示。

根据以上实施例1、2得到结果与讨论：

1、高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3的筛选

通过计算抗原蛋白平板上芽孢杆菌菌落直径与水解圈直径的比值，选择比值大于4的菌株进行发酵试验验证。

、芽孢杆菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3豆粕发酵验证

由图2所得，本方法筛选出的菌株发酵豆粕24小时后，泳道2、3、4分子量大于40kda的部分蛋白残留较少，说明抗原蛋白降解完全。而泳道1所示的普通商业菌株发酵豆粕，其在分子量为100、45部分仍留有蛋白残留，说明对抗原蛋白的降解不完全。如表1所示经ELISA发酵豆粕样品，所筛选出的菌株降解β-伴球蛋白及大豆球蛋白能力更强。所筛的菌株2016年8月8日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）， 北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号分别为 CGMCC NO:12823、CGMCC NO:12824、CGMCC NO: 12825，分类命名为Bacillus subtilis subsp.subtilis。