降低烟叶中水溶性糖的菌株及筛选方法、培养方法和应用与流程

本发明涉及一种微生物菌株，具体涉及一种可降低烟叶中水溶性糖的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，及其筛选方法、培养方法和该菌株在烟叶中的应用。

背景技术：

烟叶是卷烟生产的原料，烟叶质量的好坏直接关系到卷烟品质的高低。烟叶的化学常规成分主要是：总植物碱、水溶性总糖、还原糖、总氮、氯和钾，还含有蛋白质、淀粉、纤维素、果胶等大分子化合物，这些成分在烟叶中的含量以及某些成分之间的比例关系，对烟叶品质有着重要的影响。烟叶中的水溶性糖包括还原糖和非还原性水溶性糖，在一定范围内，糖含量高，烟气协调，卷烟吃味醇和。通常烟叶中总糖/总植物碱的值(简称糖碱比)接近10的烤烟烟叶质量最好，一般为6-10。但某些烟叶(特别是一些北方地区烟叶)水溶性糖含量过高，导致糖碱比极度失调，这样的烟叶抽吸起来，协调性差，烟气发酸，满足感弱。

技术实现要素：

本发明的目的是针对某些烟叶水溶性糖含量过高，糖碱比严重失调，烟叶质量差的问题，提供一种可降低烟叶中水溶性糖的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

本发明的另一个目的是提供了所述的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的筛选方法；

本发明的又一个目的是提供了异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的培养方法；

本发明的又一个目的是提供了提供了异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)在降低烟叶中水溶性糖应用。

为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：

一种降低烟叶中水溶性糖的菌株，所述的菌株为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC 10337。

本发明还提供了所述的异常威克汉姆酵母的培养和显微形态特征如下：

麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、卵形、腊肠形，大小为(2.6～8.8)×(2.6～4.3)μm；

麦芽汁琼脂斜面25℃培养一个月，菌落奶酪状，乳白色，表面平滑，不反光，边缘树根状；

玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝。

本发明提供了所述的降低烟叶中水溶性糖的菌株的筛选方法，包括以下步骤：

步骤A：取土壤样品9～10g于90mL富集培养基中，然后于温度28～32℃下培养92～100h得到富集培养液，培养过程中如有菌丝长出，挑出弃去；

步骤B：取富集培养液1～1.2mL，放入装有熔化后冷却至48～52℃的分离培养基的培养皿，凝固后置于温度28～32℃的恒温培养箱中培养45～50h；然后挑选生长的菌落接入驯化培养基中，于温度28～32℃下静置培养45～50h；接着将培养物梯度稀释涂布于分离培养基平板，得到单菌落，通过划线分离纯化得到异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

在上述的筛选方法中，所述的富集培养基包括下述重量份的组分：葡萄糖，20.0份；蛋白胨，10.0份；酵母膏，5份；乳酸，5份；富集培养基的pH为5.0，在121℃灭菌20min。

在上述的筛选方法中，所述的分离培养基包括下述重量份的组分：葡萄糖，60.0份；蛋白胨，10.0份；酵母膏，5份；乳酸，5份；分离培养基的pH为6.0，在121℃灭菌20min。

在上述的筛选方法中，所述的驯化培养基包括下述重量份的组分：：葡萄糖，60.0份；蛋白胨，10.0份；酵母膏，5份；乳酸，5份；驯化培养基pH 5.0，在121℃灭菌20min。

本发明还提供了所述的降低烟叶中水溶性糖的菌株的培养方法，包括以下步骤：

步骤a：斜面培养：将冷冻保存的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)接种到麸皮汁斜面培养基上，于温度28～32℃下静置培养1-2天；

步骤b：摇瓶液体培养：将质量分数为1％的葡萄糖水溶液1000mL高压蒸汽灭菌；将步骤a所得菌体接种到葡糖糖水溶液上，然后于温度28～32℃、摇床转速140-160r/min的条件下摇瓶培养18～24h，培养至菌数达10¹⁰以上，得到种子液。

在上述的培养方法中，所述的麸皮汁斜面培养基的制备步骤如下：25g麸皮加水150mL，加热煮沸后计时25～35min，过滤，滤液补足100mL，然后加入葡萄糖2g、酵母膏0.5g、琼脂1.5g。

本发明还提供了所述的降低烟叶中水溶性糖的菌株在降低烟叶中水溶性糖的应用，将种子液按照烟叶重量的5～30％，加入到烟叶中，然后于温度20～45℃下发酵1～6天。

在上述的应用中，优选的，将种子液按照烟叶重量的20～30％，加入到烟叶中，然后于温度20～45℃下发酵1～6天。

本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：

本发明提供了一株异常威克汉姆酵母，该菌株生长繁殖力强、菌丝生长旺盛。使用该菌株发酵处理糖含量高、糖碱比严重失调的烟叶，能降低水溶性含量20～95％，具有较好的稳定性和重现性，发酵后烟叶协调性提高，烟气酸气减弱，有回甜味，满足感增强，感官质量明显改善。

附图说明

图1为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的菌落形态；

图2为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的细胞形态；

异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的保藏说明：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；

保藏编号：CGMCC 10337；

保藏时间：2015年1月12日。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。

实施例1：异常威克汉姆酵母的筛选和分离：

取土壤样品(四川凉山姜州烟田土壤)10g于90mL富集培养基中，30℃静置培养至96h，培养过程中如有菌丝长出，挑出弃去。取富集培养液1mL，放入装有熔化后冷却至50℃分离培养基的培养皿中混合均匀，凝固后放于30℃恒温培养箱培养48h。挑取生长的菌落接入驯化培养基中，30℃静置培养48h，将培养物梯度稀释涂布于分离培养基平板，得到单菌落，通过划线分离纯化得到异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

所述富集培养基为：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5g，乳酸5g，pH 5.0，121℃灭菌20min，

所述分离培养基为：葡萄糖60.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5g，琼脂1.5g，pH 6.0，121℃灭菌20min。

所述驯化培养基：葡萄糖60.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5g，乳酸5g，pH 5.0，121℃灭菌20min。

异常威克汉姆酵母的培养和显微形态特征如下，详见图1和图2：

麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、卵形、腊肠形，大小为(2.6～8.8)×(2.6～4.3)μm；

麦芽汁琼脂斜面25℃培养一个月，菌落奶酪状，乳白色，表面平滑，不反光，边缘树根状；

玉米粉琼脂Dalmau平板培养，不产生假菌丝。

本发明筛选的异常威克汉姆酵母具有rRNA基因D1D2区序列。

实施例2：异常威克汉姆酵母的种子液的制备：

将实施例1得到的异常威克汉姆酵母Y05菌落进行扩大培养及生产，获得蜡状芽孢杆菌(代号Y15)种子液。

斜面培养：将冷冻保存的异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y05菌种接种到麸皮汁斜面培养基上，30℃恒温静止培养1-2天。所述麸皮汁斜面培养基为：25g麸皮加水150mL，加热煮沸后计时30min，过滤，滤液补足100mL，加入葡萄糖2g，酵母膏0.5g，琼脂1.5g。

摇瓶液体培养：1％葡萄糖水溶液1000mL，高压蒸汽灭菌，将斜面培养所得的菌体接种到培养基液体中，培养温度：30℃，摇床转速140-160r/min，摇瓶培养18-24h，培养至菌数达10¹⁰以上，得到种子液。

实施例3：

将实施例2得到的异常威克汉姆酵母种子液按照烟叶重量的30％，加入到含水量15％的烟叶中，30℃条件下发酵6天，与未发酵处理空白烟叶相比，发酵烟叶中水溶性总糖含量降低60.5％，感官评价结果表明：发酵烟叶烟气协调性较好，酸气减弱，有回甜味，满足感增强。

实施例4：

将实施例2得到的异常威克汉姆酵母种子液按照烟叶重量的5％，加入到含水量50％的烟叶中，25℃条件下发酵2天，与未发酵处理空白烟叶相比，发酵烟叶中水溶性总糖含量降低25.4％，感官评价结果表明：发酵烟叶烟气协调性较好，酸气减弱，有回甜味，满足感增强。

实施例5：

将实施例2得到的异常威克汉姆酵母种子液按照烟叶重量的20％，加入到含水量35％的烟叶中，40℃条件下发酵4天，与未发酵处理空白烟叶相比，发酵烟叶中水溶性总糖含量降低92.6％，感官评价结果表明：发酵烟叶烟气协调性变好，酸气明显减弱，有回甜味，满足感增强。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。