本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种微藻异养培养方法，其中通过稳定葡萄糖浓度而有效提高生物量和底物转化率。
背景技术：
：微藻因其富含蛋白质、脂类、多糖、维生素、抗氧化剂和其它功能性营养成分，在医药原料、保健食品及生物能源领域具有广泛的应用。目前，微藻培养技术多集中于光自养体系，该培养体系存在生产效率低、占地面积大、收获成本高等不足，严重制约了微藻产业的发展。通过人工大规模培养技术提高微藻生物量是微藻资源开发利用的关键。近年来，逐渐兴起了微藻异养高细胞密度培养技术，该技术可以克服光培养体系对光的限制，具有生长速度更快、能实现纯种培养、细胞产率高、便于自动化控制等优势，已成为近年来微藻培养研究的热点。本领域需要一种高效的微藻异养高密度培养方法。技术实现要素：本发明提供了一种微藻例如栅藻的异养培养方法，所述方法包括在培养过程中使培养物中碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/l。通过本发明的方法，有效地提高微藻例如栅藻的生物量和底物转化率，且无需额外调节ph值。附图说明图1示出目前普遍使用的脉冲式补料方式(对照组)下葡萄糖浓度随时间变化情况。在此补料方式下，葡萄糖浓度在0-20g/l的范围内剧烈波动。图2为采用本发明所采用的补料方式下葡萄糖浓度随时间变化情况。在此补料方式下，根据葡萄糖浓度的适时测量，及时调整补料速度，将葡萄糖浓度分别控制在三个不同的小范围内。图3为对照组和3个实验组下生物量浓度随时间变化的比较。采用本发明所采用的补料方式的各实验组的最高生物量浓度明显高于对照组，且experiment1和experiment2下同期的生物量浓度明显高于对照组，因此在获得相同的生物量下的培养时间大大缩短。发明详述本发明提供一种微藻异养培养方法，所述方法包括在培养过程中使培养物中碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/l。在本发明中“碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/l”指的是任意两次测量所得的碳源浓度之间的差值小于或等于大约5g/l。在本发明的方法的一些实施方案中，通过连续补料的方式添加碳源，例如通过阶段式恒速流加方式添加碳源。在一些实施方案中，在培养过程中大约每0.5-3小时测量培养物中的碳源浓度，并根据测得的碳源浓度调整补料速度，从而使碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/l。在一些实施方案中，所述补料速度为大约5g/小时-大约1000g/小时。本领域技术人员可以根据测得的碳源浓度以及培养物的体积调节所述补料速度。例如，与培养体积相关的所述补料速度可选自大约0.5g/l/h-大约25g/l/h的范围。在一些实施方案中，所述碳源是葡萄糖。在一些实施方案中，所述微藻选自小球藻(chlorella)、眼虫藻(euglenagracilis)、栅藻(scenedesmus)、扁藻(tetraselmisgracilis)、菱形藻(nitzschia)、富油新绿藻(neochlorisoleoabundans)、微拟球藻(nannochloropsis)、杜氏藻(dunaliella)。在一具体实施方案中，所述微藻是尖状栅藻(scenedesmusacuminatus)。在一些实施方案中，所述微藻的初始接种量为大约5-20％(v/v)，例如大约5％(v/v)、大约10％(v/v)、大约15％(v/v)或大约20％(v/v)。在一些实施方案中，接种后的初始细胞干重为大约0.5g/l-大约5g/l。在一些实施方案中，所述培养在大约25-40℃下进行。对于栅藻，例如尖状栅藻，优选所述培养在30℃±2℃下进行。在一些实施方案中，所述培养在大约10-60％，例如10％、20％、30％、40％、50％或60％的溶氧浓度下进行。在本发明中，“溶氧浓度”是指培养基中所溶解的氧的量相对于培养条件下培养基中氧的饱和溶解度的百分比。溶氧浓度控制方法是溶氧转速、氧气偶联。具体而言，溶氧转速、氧气偶联的控制方法是：当培养物中的溶氧值低于设定值时通过自动增加搅拌转速，来提高通入气体中氧气在培养物中的溶解，当转速增加至设定最大值而溶氧浓度仍低于设定值时，再通过增加通气(空气和氧气的混合气体)中氧气的比例，来增加溶氧；当培养物中的溶氧浓度高于设定值时通过自动降低通气中氧气的比例，来降低溶氧；当氧气比例降至0，通100％空气时，溶氧浓度仍高于设定值时，再通过自动降低搅拌转速方式进一步降低溶氧浓度，直至降至设定值。在一些实施方案中，所述培养的初始碳源浓度为大约5-40g/l，例如大约5g/l、大约10g/l、大约15g/l、大约20g/l、大约25g/l、大约30g/l、大约35g/l或大约40g/l。在一些实施方案中，所述培养过程的碳源浓度被控制在以下范围：大约0-5g/l、大约5-10g/l、大约10-15g/l、大约15-20g/l、大约20-25g/l、大约25-30g/l或大约35-40g/l。在一些实施方案中，所述培养在大约5-100000l的生物反应器如发酵罐中进行。相应地，所述培养物的初始体积可以为大约2-40000l。在一些实施方案中，所述方法中使用如表2和表3中所示的培养基。脉冲式补料方式是现有技术中微藻异养高密度培养过程中应用最为广泛的一种基质流加方式，已广泛应用于小球藻[1-4]和眼虫藻[5]等的高密度培养。脉冲式补料是在整个异养培养周期(>150h)中，当测到葡萄糖消耗殆尽时，然后短时间内加入大量葡萄糖，在整个培养过程中只会加3-5次料。本发明人发现该补料方式可能存在如下缺点(不受任何已知理论限制)：1)补料阶段的基质浓度呈脉冲式变化，补料时基质浓度瞬时波动较大，造成细胞的增殖速度低；2)短时间内基质的大量添加导致细胞对氧的需求也急剧增加，进而造成发酵过程中氧的瞬间供应不足和抑制性代谢副产物(如乙醇或乙酸)的生成；3)培养过程中的ph会因补料液的大量加入而急剧变化，造成不必要的酸或碱的添加，从而增加了额外的酸碱调节设备和成本。本发明人令人惊奇地发现，采用本发明的方法，通过适时检测碳源浓度并结合调节流加速度大小，可以有效控制培养过程中碳源浓度的变化幅度，从而避免脉冲式补料方式下碳源浓度短时间大幅波动对细胞生长的抑制作用，使得细胞的生长速度更快，最高细胞浓度更高，底物的转化率也更高。本发明整个流加培养过程中无需通过碱液调控ph，省掉供碱装置和碱液的供应成本。在一个具体的方面，本发明提供了一种异养培养栅藻，例如尖状栅藻的方法，所述方法包括以下步骤：a)将栅藻接种于包含固体活化培养基上，在光强30～50μmolm-2s-1，25℃±2℃下培养15-20天；b)挑取步骤a)中获得的栅藻至液体一级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养120-144小时或培养至od750＝8-12；c)将步骤b)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于液体二级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养72-84小时或培养至od750＝16-20；d)将步骤c)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于液体三级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养72-84小时或培养至od750＝20-22；e)将步骤c)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于发酵罐中的发酵基础培养基中，在30℃±2℃下以大约10-60％的溶氧浓度进行培养，其中所述发酵基础培养基包含5-20g/l的初始葡萄糖浓度，所述发酵罐的搅拌速度设置为与溶氧浓度偶联控制；f)在步骤e)培养期间通过阶段式恒速流加方式添加补料培养基，其中大约每0.5-3小时测量培养物中的葡萄糖浓度并根据测得的葡萄糖浓度调整补料速度，从而使碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/l；和任选地g)收获所培养的栅藻。在一实施方案中，所述方法中使用的培养基如表1-3所示。实施例现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。实验材料的准备藻株：尖状栅藻(公开于[6-7])栅藻培养过程中所用的各培养基组成和用量见下表1-3。表1藻种制备培养基：表2发酵罐基础和补料培养基组成组成成分基础培养基(g/l)补料培养基(g/l)葡萄糖5～20750尿素0.25～1.037.5kh2po40.3～1.230mgso4·7h2o0.3～1.230柠檬酸三钠0.05～0.25cacl2母液1ml12.5mlfeso4与edta母液1ml12.5ml微量元素母液1ml12.5ml消泡剂0.08ml750表3各培养基母液组成整个尖状栅藻培养过程包括如下4个基本步骤：1)藻种活化在无菌环境下，用接种环从已培养好的平板上挑取栅藻单菌落，于灭菌平板上(培养基组成见表1)进行划线，将划线后的平板置于恒温光照培养箱中进行培养，光强30～50μmolm-2s-1，培养温度25℃，培养15-20天(形成明显的栅藻单菌落)。2)一级种子培养从活化好的新鲜平板上，挑取一环栅藻(直径2～3mm)于50ml三角瓶中(含15ml培养基)进行振荡培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养120-144h(od750＝8-12)。3)二级种子培养将培养好的一级种子液以10％(v/v)接种量接种于250ml二级摇瓶(含100ml培养基)中进行振荡培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养72～84h(od750＝16-20)。3)三级种子培养将培养好的二级种子液以10％(v/v)接种量接种于1000ml三级摇瓶(含300ml培养基)中进行振荡培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养72-84h(od750＝20-22)。4)发酵罐培养将培养好的三级摇瓶种子液以10％(v/v)接种量接种于7.5l发酵罐中，培养温度30℃，通风比为1：1(vvm)，ph6.0，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为40％。初始葡萄糖浓度为5-20g/l，当培养过程中的葡萄糖浓度较初始浓度降低3-4g/l时，开始使用速度可调的蠕动泵流加补料液，每2-4h适时取样测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度变化在5g/l范围内。当以获得最大细胞干重为目的时，连续两次取样点样品发酵干重不变或者开始下降时，发酵培养结束，一般发酵时间为220h左右。实验中的测量方法：取样测量细胞浓度的方法：采用称重法，即将发酵样品稀释至合适浓度(od750＝2-10)后，取一定体积(1-5ml)加入经80℃烘干过夜称重后的英国whatmangf/c玻璃纤维滤膜上，经0.5mnahco3溶液冲洗抽滤后，80℃烘干过夜，计算细胞干重。葡萄糖浓度的测量方法：将发酵样品经离心后，取上清液，将上清液经适当稀释后，采用安稳型血糖试纸条进行测定。实施例1、experiment1发酵罐体积7.5l，初始发酵液体积2.5l，接种量10％，培养温度30℃，ph6.0，通风比1:1(vvm)，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为40％，初始葡萄糖浓度5g/l。当葡萄糖浓度下降至约1g/l的水平时开始流加补料液，使用保定兰格bt100-2j型蠕动泵(泵头型号为yz1515x)进行流加。补料采用阶段式恒速流加方式，初始补料速度为6g/h。发酵过程中每隔2h测定葡萄糖浓度。根据葡萄糖浓度的变化调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在5g/l以下，且任意测定时间点之间的葡萄糖浓度变化小于5g/l。本实施例中，葡萄糖浓度变化如图2中的experiment1。培养时间为216h。实施例2、experiment2发酵罐体积7.5l，初始发酵液体积2.5l，接种量10％，培养温度30℃，ph6.0，通风比1:1(vvm)，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为40％，初始葡萄糖浓度10g/l。当葡萄糖浓度下降至约6g/l的水平时开始流加补料液，使用保定兰格bt100-2j型蠕动泵(泵头型号为yz1515x)进行流加。补料采用阶段式连续流加方式，初始补料速度为6g/h。发酵过程中每隔2h测定葡萄糖浓度。根据葡萄糖浓度的变化调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在10g/l以下，且任意测定时间点之间的葡萄糖浓度变化小于5g/l。发酵过程中每天取样测定细胞干重，发酵周期216h。本实施例中，葡萄糖浓度变化如图2中的experiment2。实施例3、experiment3发酵罐体积7.5l，初始发酵液体积2.5l，接种量10％，培养温度30℃，ph6.0，通风比1:1(vvm)，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为40％，初始葡萄糖浓度20g/l。当葡萄糖浓度下降至约16g/l的水平时开始流加补料液，使用保定兰格bt100-2j型蠕动泵(泵头型号为yz1515x)进行流加。补料采用阶段式连续流加方式，初始补料速度为6g/h。发酵过程中每隔2h测定葡萄糖浓度。根据葡萄糖浓度的变化调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在20g/l以下，且任意测定时间点之间的葡萄糖浓度变化小于5g/l。发酵过程中每天取样测定细胞干重，发酵周期216h。本实施例中，葡萄糖浓度变化如图2中的experiment3。实施例4、对照组发酵罐体积7.5l，初始发酵液体积2.5l，接种量10％，培养温度30℃，ph6.0，通风比1:1(vvm)，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为40％，初始葡萄糖浓度20g/l。当葡萄糖浓度下降至约为0g/l时开始流加葡萄糖，补料采用脉冲式流加方式。补料速度恒定在720g/l，补料时间7-10min。当补料后的葡萄糖浓度达到约20g/l时，停止流加。当培养过程中葡萄糖浓度再次下降至约0g/l时，按照初次流加方式进行流加。控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在20g/l以下，直至发酵结束。发酵过程中每天取样测定细胞干重，发酵周期216h。(对照组中葡萄糖浓度变化为图1，对照组生物量浓度随时间变化如图3)表4对实施例1-4不同实验组和对照组的主要发酵性能指标进行了比较。本发明中3个实验组下的各性能指标均优于对照组，而且，各实验组整个培养过程中不消耗碱液(3mnaoh)。表4本发明各实验组合对照主要发酵性能指标比较实施例5、放大实验发酵罐体积500l，初始发酵液体积200l，接种量15％，培养温度32℃，ph6.0，通风比1:1(vvm)，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为40％，初始葡萄糖浓度18g/l，当葡萄糖浓度下降至约13g/l的水平时开始流加补料液，使用大型蠕动泵(型号为杰恒jl300-483k_)进行流加，补料采用阶段式恒速流加方式，初始补料速度为500g/h，发酵过程中每隔3h测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在5g/l以下，且任意时间内葡萄糖浓度变化小于5g/l。培养时间为220h。葡萄糖浓度的控制水平在13-18g/l之间波动，培养结束时测的最大生物量浓度170g/l，葡萄糖-细胞转化率51％，生物质生长速率达到1.02g/l/h；对于同等中试体积的培养体系而言，按照本发明葡萄糖浓度恒定控制方法培养，其底物转化率、最大生物量均获得较优的实验结果，使微藻的应用具有理想的产业应用前景。参考文献[1]xiongw,lixf,xiangjy,wuqy.high-densityfermentationofmicroalgachlorellaprotothecoidesinbioreactorformicrobiodieselproduction.applmicrobiolbiotechnol,2008,78(1):29-36.[2]shixm,jiangy,chenf.high-yieldproductionofluteinbythegreenmicroalgachlorellaprotothecoidesinheterotrophicfed-batchculture.biotechnolprog,2002,18(4):723-727.[3]douchaj,k.productionofhigh-densitychlorellaculturegrowninfermenters.japplphycol,2012,24(1):35-43.[4]sansawah,endoh.productionofintracellularphytochemicalsinchlorellaunderheterotrophicconditions.jbioscibioeng,2004,98(6):437-444.[5]ogbonnajc,tomiyamas,tanakah.heterotrophiccultivationofeuglenagraciliszforefficientproductionofalphatocopherol.1998,japplphycol10(1):67-74.[6]罗舒怀等，低氮对产油尖状栅藻荧光特性及色素蛋白复合物的影响，植物生理学报plantphysiologyjournal2015,51(9):1425-1432。[7]雷学青等，利用平板反应器大量培养高产油绿藻—尖状栅藻的生长和油脂积累规律，中国生物工程杂志chinabiotechnology，2014，34(11):91-99。当前第1页12