一种口腔鳞癌细胞株、其制备方法及应用与流程

本发明属于生命医学领域，具体涉及一种口腔鳞癌细胞株、其制备方法及相关应用。

背景技术：

口腔癌作为头颈部恶性肿瘤的重要组成部分，其发生率逐年上升。口腔癌中，90％以上为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)。口腔鳞癌是指发生在口腔正常黏膜上皮的鳞状细胞癌，又称口腔黏膜细胞癌。吸烟、酗酒和刺激性饮食被认为是口腔鳞癌的主要危险因素。由于口腔位于头颈部正中，同时又是呼吸系统和消化系统的共同起始端，该部位的恶性肿瘤往往直接影响患者的吞咽、咀嚼、呼吸、说话、美观等重要功能。局部病灶的扩大切除术并结合预防性颈淋巴结清扫术是目前手术治疗的主要方法，但这会造成患者术后呼吸、吞咽、咀嚼以及言语等相关功能完整性的破坏和减退，严重降低了患者术后的生活质量，且患者术后5年生存率仅50％-60％，且在淋巴结转移的患者中则更低。近年来随着口腔鳞癌传统治疗手段的不断改进及肿瘤免疫治疗的研究，采用化疗药物及免疫方法治疗口腔鳞癌成为可能。

肿瘤细胞系在肿瘤的分子发生机制、生物标记物的寻找以及化疗及靶向治疗药物开发等研究中，具有举足轻重的作用。尽管人源性肿瘤组织来源的肿瘤细胞系，具有与人类肿瘤相似的遗传背景和生物学特性，但是由于物种间差异存在免疫排斥，该类细胞系在正常免疫动物成瘤均不佳，在免疫缺陷动物体内的成瘤又忽略了免疫系统在肿瘤发生及发展中的作用。

人口腔癌细胞株目前存在多种，为了更好的研究口腔癌发生、发展及预后，往往使用小鼠作为动物疾病模型，研究体内环境及验证相关的分子机制。动物疾病模型作为研究疾病的重要工具，虽然在种属上存在某些缺陷和不足，但仍能很好的反应该疾病的发生和发展。因此，小鼠口腔癌细胞系是研究口腔癌变机理、肿瘤转移、肿瘤放疗和化疗敏感性分子基础等生物学问题的重要材料，建立和鉴定小鼠口腔癌细胞株具有重要科学意义。

在研究口腔癌发生发展机制时，往往需要用肿瘤细胞建立动物模型从体内进行验证：裸鼠成瘤及肺转移实验。然而，这都忽略了免疫系统对肿瘤发生及转移的影响；在运用这类细胞系和裸鼠动物模型筛选或研发新的治疗癌症的药物时，忽视了免疫系统对抗癌药物效果的影响，也忽视了抗癌药物对免疫系统功能的影响。因此，建立一株小鼠来源的、能在正常免疫力小鼠体内成瘤的口腔癌细胞株，更能真实的反映肿瘤发生发展，对于研究口腔癌发生、发展、治疗药物及治疗效果具有重要的临床意义。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种口腔鳞癌细胞株、其制备方法及应用。

本发明第一方面提供了一种口腔鳞癌细胞株——MAL基因敲除鼠舌鳞癌细胞系Mca-T-MAL^-/-，其特征在于，该菌株已于2016年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏号为CCTCCNO:C2016117。所述的口腔鳞癌细胞株为采用含4-硝基喹啉-1氧化物饮水诱导小鼠，至其口腔舌部黏膜发生肿瘤,得到口腔鳞癌组织。

本发明第二方面提供了一种上述的口腔鳞癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：采用含4-硝基喹啉-1氧化物饮水诱导小鼠，得到口腔鳞癌组织；

步骤二：将所述的口腔鳞癌组织进行原代培养，得到原代细胞；所培养的原代细胞为多边形上皮细胞，具有典型的肿瘤细胞生物学特性，它能在体外连续长期传代，在体外培养一年，传至100多代，细胞仍生长增殖活跃；后采用有限稀释法筛选出单克隆细胞，经体外传代至50代仍生长活跃，且增殖时间，克隆形成能力，迁移能力和肿瘤细胞相关分子表达结果，提示该细胞株具有肿瘤细胞生物学特性。

步骤三：将所述的原代细胞进行纯化并连续培养，并筛选细胞株，得到所述的口腔鳞癌细胞株。

所述的小鼠为MAL基因敲除C57BL/6J小鼠。

所述的步骤二中的原代培养为在所述的口腔鳞癌组织中加入胰酶，孵育后，进行贴壁培养而得到的。

所述的步骤三中，采用有限元稀释法筛选细胞株。

所述细胞株为在原代细胞中经过单克隆法筛选出的细胞株，其在倒置光学相差显微镜下观察，可见细胞呈多角形或者椭圆形，成团接触生长，核大，胞浆丰富，细胞间连接紧密，与平皿之间贴附生长。HE染色见细胞核圆形、椭圆形或肾形，染色较淡，常位于中央，核仁明显，常为3-4个。

所述细胞株的蛋白表达特征为：蛋白印迹实验证实与EMT密切相关的蛋白，筛选细胞株的E-cadherin和Ki67均较原代未筛选细胞高表达，免疫组化结果同蛋白印迹结果相似，在筛选细胞株中，角蛋白CK染色强阳性，大部分细胞E-cadherin表达阳性，且免疫组织化学染色显示其与人口腔癌细胞有着相似的蛋白谱表达。

细胞在裸鼠皮下可成瘤，裸鼠尾静脉注射肺转移实验也证实该细胞株可产生肺转移。

将裸鼠皮下所成瘤体组织修剪成极小组织块(1-2毫米直径)后，移植至正常免疫C57BL/6J小鼠皮下，可见瘤体生长形成肿瘤。

本发明第三方面提供了上述的口腔鳞癌细胞株在临床化疗药物动物体内治疗效果评价中的应用。

本发明第四方面提供了上述的口腔鳞癌细胞株在研发抗癌药物中的应用。

本发明第五方面提供了口腔鳞癌细胞株在研究MAL基因功能中的应用。

本发明提供的口腔鳞癌细胞株具有典型的肿瘤细胞生物学特性，可作为研究口腔癌发生、发展及口腔癌肺转移的细胞及动物疾病模型。可用于在细胞水平上研究口腔癌的发生、发展和转移的机理；可作为临床化疗药物的治疗效果评价及研制和/或筛选治疗口腔鳞癌药物的工具。更有价值的是，该细胞株成瘤后瘤体组织可在正常免疫力小鼠皮下成瘤，可为研究免疫与肿瘤发生学及转移、肿瘤的免疫治疗药物筛选和抗瘤效果验证等生物医学问题提供重要工具。

附图说明：

图1为小鼠口腔鳞癌细胞株的镜下观及染色图。

图2为小鼠口腔鳞癌组织病理图。

图3为裸鼠皮下成瘤瘤体切片染色图。

图4为裸鼠肺组织转移瘤体切片染色图。

图5为正常免疫小鼠皮下瘤体切片染色图。

图6为小鼠的肿瘤切片染色图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。

经4-硝基喹啉-1氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)饮水诱导的MAL基因敲除鼠20周后，小鼠口腔舌部黏膜可见一菜花状肿物，切取部分肿瘤组织经原代培养后建立的口腔癌细胞株，命名为MAL基因敲除小鼠舌鳞癌细胞株(MAL-/-mouse tongue cancer cell line，Mca-T-MAL-/-)，保藏号为CCTCC NO:C2016117。

实施例一

该小鼠口腔癌口腔癌的细胞株，按照以下方法制备所得：

步骤一：小鼠口腔癌组织块的获取：用常规小鼠口腔癌诱导剂4NQO(80微克/毫升)饮水诱导MAL基因敲除小鼠20周后，编号为167#的雌性小鼠舌背部黏膜发现一菜花状病灶，病理诊断为口腔鳞癌，见图2，用消毒后的手术器械快速切除舌尖肿物，并以消毒小剪刀迅速解离肿瘤标本，用含1％青-链霉素双抗的高糖DMEM溶液浸泡移至生物安全柜，含双抗的消毒PBS缓冲液反复清洗组织去除粘液和红细胞等杂质后得到剩余的组织；

步骤二：组织块法结合胰酶消化法原代培养肿瘤细胞：将步骤一得到的剩余的组织粗切成小组织块，用PBS缓冲液清洗，让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，离心，去除上清后加1ml胰酶，在37℃孵育消化30分钟后，离心，去胰酶，加入1ml含20％胎牛血清的高糖DMEM培养基，重悬收集的肿瘤组织块，进行贴壁培养，过夜后加入2ml培养基，每3天换液，可得到原代肿瘤细胞；

步骤三：对步骤二得到的存活细胞进行纯化，含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基进行肿瘤细胞培养，每3天传代一次，连续培养并传代超过100代，细胞生长增殖仍活跃；

步骤四：有限元稀释法筛选口腔癌细胞株：采用有限元稀释法对步骤三中细胞筛选肿瘤细胞株，将步骤三中细胞制备成10个/ml细胞悬液后，接种至96孔板，每孔100μl进行单细胞培养，每3天换液，并成功获取肿瘤细胞的单克隆株，该单克隆株传代至50代，仍活跃生长，即得细胞株Mca-T-MAL^-/-。

Mca-T-MAL^-/-是一株C57小鼠口腔癌细胞系，来源于一只MAL基因敲除的雌性小鼠的舌部黏膜菜花状病灶，病理诊断确定为口腔鳞癌，见图2。

实施例二

本发明所述小鼠口腔癌细胞株Mca-T-MAL^-/-的检测鉴定

1、形态观察

主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等，以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。

1.1倒置光学显微镜观察

主要在正常生长状态下观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、粘附特性等。

倒置光学相差显微镜下观察本发明所述小鼠口腔癌细胞株Mca-T-MAL^-/-，可见细胞呈多角形或者椭圆形，成团接触生长，核大，胞浆丰富，细胞间连接紧密，与平皿之间贴附生长。HE染色见细胞核圆形、椭圆形或肾形，染色较淡，常位于中央，核仁明显，常为3-4个。见图1。

1.2免疫组化检测细胞标记蛋白

采用免疫组化染色，免疫组化染色试剂盒购自上海基因科技生物技术开发有限公司。所用的抗体为：Ki67、CK和E-cadherin。

具体步骤为：

步骤一：待检测细胞株消化后制备成适宜浓度细胞悬液后，接种于消毒爬片上，过夜后，用PBS缓冲液冲洗2次，每次3-5分钟，冷4％多聚甲醛固定15分钟，浸泡于PBS中备用；

步骤二：取所需玻片加50μl3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，室温下孵育15分钟；PBS冲洗三次，每次3分钟；

步骤三：除去PBS液，每张切片加50μl正常非免疫动物血清，室温下孵育15分钟；

步骤四：除去血清，每张切片加50μl的一抗，4度孵育过夜；

步骤五：PBS冲洗三次，每次3-5分钟；除去PBS液，每张切片加50μlHRP生物素标记的二抗，室温下孵育30分钟；PBS冲洗三次，每次3分钟；

步骤六：除去PBS液，每张切片加80μl新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察显色，并适时中止显色；

步骤七：自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；

步骤八：经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

步骤九：本发明所述小鼠口腔癌细胞株Mca-T-MAL^-/-的免疫组织化学染色显示，其与人来源的口腔癌组织有着相似的蛋白表达，证实与EMT密切相关,见图1。

2、细胞生长增殖

检测细胞生长曲线、倍增时间、平板克隆和细胞周期/凋亡。

2.1CCK-8法测定细胞生长增殖

步骤一：制备2×10⁴个/ml靶细胞细胞悬液，取96孔板，每孔中加100μl细胞悬液，分1、3、5和7天四个时间点，每个时间点5个复孔，在37℃细胞培养箱中孵育过夜后，让细胞贴壁；空白对照孔，每孔加100μl细胞培养基，不加细胞；

步骤二：分别于培养后1、3、5和7天各孔中加入10μlCCK-8，37度孵育2小时，于450nm波长下检测OD值，从而检测细胞增殖，结果见图3。

2.2细胞计数法绘制细胞生长曲线

步骤一：制备2×10⁴个/ml靶细胞细胞悬液，接种于24孔板，每孔中加1ml细胞悬液，在37℃细胞培养箱中孵育过夜后，让细胞贴壁；分1、2、3、4、5、6和7天时间点，每组4个复孔；

步骤二：分别于培养后1、2、3、4、5、6和7天PBS清洗细胞2次，加入胰酶0.5ml消化细胞后，进行细胞计数，计算出细胞总数后，绘制出细胞生长曲线；

步骤三：本发明所述细胞株的体外倍增时间为27.95h，见图3。

2.3平板克隆

步骤一：制备1×10⁴个/ml靶细胞细胞悬液，接种100μl细胞悬液于含10ml培养基的10cm皿中，在37℃细胞培养箱中孵育2周，每3天换液；

步骤二：于培养2周后，用PBS清洗细胞2次，加入5ml4％多聚甲醛固定15min后，PBS清洗细胞2次；

步骤三：加入5ml1％结晶紫染色15min，流水清洗凉干后拍照，进行克隆计数，计算出克隆总数，并统计结果，见图3；

2.4检测细胞凋亡

细胞凋亡水平分析采用FITC/Annexin V凋亡试剂盒(BD Biosciences,USA)，细胞通过Annexin V(Propidium Iodide,PI)和碘化丙啶双染后，使用LSRⅡ型流式细胞仪检测其凋亡水平，步骤如下：

步骤一：制备5×10⁵个/ml靶细胞细胞悬液，按每孔接种5×10⁵个于6孔板中，在37℃细胞培养箱中孵育过夜后，换无血清无双抗培养基饥饿24小时，使细胞同步化，再换为血清培养基培养24小时；

步骤二：胰酶消化收集悬浮和贴壁生长细胞，预冷PBS洗2遍，1500rpm离心5min；

步骤三：弃上清，100μl的1×binding buffer重悬细胞；加入5μl Annexin V混匀后室温孵育15分钟；

步骤四：加入3μlPI混匀后室温孵育5min后，加入300μl 1×binding buffer混匀，冰上避光放置30min；

步骤五：BD流式细胞仪检测分析，发现本发明细胞株的基础凋亡水平在6.03％左右，见图3。

2.5检测细胞周期

步骤一：制备5×10⁵个/ml靶细胞细胞悬液，按每孔接种5×10⁵个于6孔板中，在37℃细胞培养箱中孵育过夜后，换无血清无双抗培养基饥饿24小时，使细胞同步化，再换为血清培养基培养24小时；

步骤二：胰酶消化收集细胞，预冷PBS洗2遍后用75％酒精重悬细胞，-20度固定过夜；

步骤三：将细胞1500rpm离心5min后弃乙醇，PBS洗3遍后，500μlPI/RNase Staining Buffer重悬细胞，冰上避光孵育30min；

步骤四：BD流式细胞仪检测分析，周期结果见图3。

实施例三

本发明所述小鼠口腔癌细胞株Mca-T-MAL^-/-体内动物模型的建立

实验选取6周BALB/C裸鼠，雌雄各半，所有动物实验均按照上海交通大学医学院批准的动物实验操作准则进行。

1、裸鼠皮下成瘤

步骤一：实验细胞分两组，分别为本发明的细胞株Mca-T-MAL^-/-和未筛选的原代小鼠口腔癌细胞；

步骤二：细胞消化计数后，用无血清无抗生素的DMEM洗2遍，用无血清无双抗DMEM将细胞稀释成1×10⁷个/ml的细胞悬液，冰上保存；

步骤三：每只裸鼠选取两个注射点，于左右大腿外侧皮下注射100μl细胞悬液，左侧注射本发明细胞株，右侧注射未筛选的细胞株，防止悬液溢出；

步骤四：定期测量体重，并观察瘤体大小，测量瘤体的最大径和最小径，肿瘤体积＝最大径×最小径×最小径/2；每周测量一次，至第8周肿瘤达到一定程度时终止实验，并以肿瘤体积为纵坐标，时间为横坐标，绘制肿瘤生长曲线；

步骤五：收集标本，中性福尔马林固定后石蜡包埋切片，行HE染色确定肿瘤性质，见图4。细胞体积大，核大，核仁明显，细胞形态与细胞株相似。

2、裸鼠肺转移实验

步骤一：实验细胞为本发明的细胞株；细胞消化计数后，用无血清无抗生素的DMEM洗2遍，用无血清无双抗DMEM将细胞稀释成5×10⁷个/ml的细胞悬液，冰上保存备用；

步骤二：用胰岛素注射器吸取混匀的细胞悬液，于裸鼠尾静脉进行注射，每只缓慢注射200μl，注射完成后密切观察动物状态；

步骤三：注射后每天观察小鼠状态，每周称重一次，至第15周时，动物精神萎靡且皮肤潮红时，即可考虑终止实验；

步骤四：收集标本，解剖分离肺组织，并观察肺形态改变、拍照记录，见图5，石蜡包埋后切片，HE染色确定肿瘤性质；细胞体积大，核大，核仁明显，细胞形态与细胞株相似。

3、免疫力正常小鼠皮下成瘤实验

步骤一：C57小鼠麻醉后腹部移植部位备皮，将本实施例中1裸鼠皮下成瘤的瘤体组织作为对象；将肿瘤组织用消毒器械剪成大小约1mm*1mm*1mm组织，用无血清无抗生素的PBS洗2遍，冰上保存备用；

步骤二：用刀片在小鼠腹部中间切一大小约3-5mm的横形切口，并钝性分离皮下组织，将瘤体组织移植至小鼠皮下，使瘤体组织距离切口大于1cm，完成后紧密缝合伤口并密切观察动物状态；

步骤三：定期测量体重，并观察瘤体大小，测量瘤体的最大径和最小径，肿瘤体积＝最大径×最小径×最小径/2；每周测量一次，至第6周肿瘤达一定程度时终止实验，并以肿瘤体积为纵坐标，时间为横坐标，绘制肿瘤生长曲线；

步骤四：收集标本，中性福尔马林固定后石蜡包埋切片，行HE染色确定肿瘤性质，见图6；染色形态如图所示，细胞体积大，核大，核仁明显，细胞形态与细胞株相似。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。