一株防治植物根结线虫的萎缩芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株防治植物根结线虫的萎缩芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

根结线虫因其世界范围性的地理分布以及广泛的寄主范围，对许多重要的经济作物造成严重危害，被认为是世界范围内最重要的病原物之一。据估计，最常见的种可以侵染超过5500种植物。根结线虫的寄主遍及粮食、油料、蔬菜、果树等作物，例如番茄、生菜、黄瓜、花生、烟草、柑橘等植物都可被根结线虫侵染。植物根系发病后多个根结连在一起,形成大小不一的肿瘤，发病晚期根变得粗糙且容易腐烂。根部畸形导致整个植物运输系统受损，从而导致植株地上部分出现发育不良、矮化、黄化以及果实畸形等症状，更加严重时则导致植株死亡。

线虫病害在生产上已成为一类重要的顽固性病害，控制该病害的发生与蔓延是确保作物产量与品质而急需解决的问题。目前根结线虫病的防治主要有以下3种方法，即农业防治、化学防治和生物防治。

种植抗性品种是一种重要的控制线虫病害发生的农业措施，而抗病品种的缺乏限制了它的发展，而且部分抗性品种并没有很全面的应用。部分番茄抗性品种的种植与其它防治手段的联合使用虽然已经取得了一定的效果，但是因为有些品种在一些国家当地产量低，所以推广后并没有受到种植者们的欢迎。

长期以来，我国农作物的病虫害防治主要依赖化学农药，现阶段防治根结线虫的主要方法还是依赖于化学药剂。化学药剂高效，易使用，但是由于农药污染较为严重，食品中农药检出率高达90％以上，这严重危害了消费者的身体健康。同时，由于食品农药残留问题导致我国农产品出口受阻，这对我国现代农业产业的发展构成了严重影响。因此，农药残留已成为食品安全生产中急需解决的问题。相比化学农药，生物农药具有安全、环保和无残留等优点。注重低毒、高效和选择性强的生物农药开发已成为当前的研究热点之一。

目前，许多研究者提倡并在重点研究开发利用生物防治技术来控制线虫病害。生物防治措施既对环境友好，对人畜安全，又能有效控制病害的发生与蔓延所以颇受青睐。目前，许多研究者提倡并在重点研究开发利用生物防治技术来控制线虫病害。生物防治措施既对环境友好，对人畜安全，又能有效控制病害的发生与蔓延所以颇受青睐。目前已经报道过的生防真菌有淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)、厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)、被毛孢(Hissutella spp.)、绿色木霉(Trichoderma viride)等，杀线效果较好的生防细菌有巴氏杆菌(Pasteuria spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)和假单胞菌(Pseudomonas spp.)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)等。

迄今为止，利用细菌防治线虫病害的报道不少，但是关于利用萎缩芽孢杆菌防治线虫病害研究尚未被报道过。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus XZ-O2*(本发明或称为XZ-O2*菌株)，该菌株对根结线虫病有较强的防治效果。该菌株已于2016年9月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Bacillus atrophaeus XZ-O2*；保藏编号：CCTCC NO：M 2016459；地址：中国武汉武汉大学。

本发明的第二个目的是在于提供了一种Bacillus atrophaeus XZ-O2*在制备防治根结线虫病生物制剂药物中的应用，特别适合于根结线虫病的防治。

本发明最后一个目的在于提供了一种Bacillus atrophaeus XZ-O2*在促进豌豆生长中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种Bacillus atrophaeus XZ-O2*，通过以下方式获得：

申请人从中国西藏自治区土壤土样中分离、筛选得到一株对根结线虫具有较强防治效果的菌株，将其命名为XZ-O2*。通过形态学、生理生化测定及分子生物学的鉴定，鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。

该菌株已于2016年9月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Bacillus atrophaeus XZ-O2*；保藏编号：CCTCC NO：M 2016459；地址：中国武汉武汉大学。

Bacillus atrophaeus XZ-O2*菌株菌落特征：菌落圆形，乳白色，不透明，单个菌落四周隆起，中部塌陷，生长后期可产生黑褐色色素，革兰氏染色后菌体呈现紫色，为阳性菌。

平板培养Bacillus atrophaeus XZ-O2*使用的是NA培养基，该培养基组分及配方如下：蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，琼脂20g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；35℃，暗培养。

一种萎缩芽孢杆菌XZ-O2*在制备防治根结线虫病生物制剂药物中的应用，包括利用该菌株作为唯一有效成分或有效成分之一制备成防治植物植物线虫病害的药物，或利用萎缩芽孢杆菌XZ-O2*的发酵上清液制备根结线虫卵孵化抑制剂。

本发明的保护内容还包括萎缩芽孢杆菌XZ-O2*在制备生物杀线剂的应用。

一种萎缩芽孢杆菌XZ-O2*在促进豌豆生长中的应用，包括利用所述的萎缩芽孢杆菌XZ-O2*发酵液用于制备豌豆促生长制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明筛选出一株防治根结线虫病的新菌株XZ-O2*，该菌株是一种萎缩芽孢杆菌，目前没有关于该菌株防治根结线虫病的相关报道。

2.用该菌的发酵菌液，能有效地控制线虫病害的发生和危害。本发明筛选出的XZ-O2*菌株对根结线虫线虫在室内生测试验中，XZ-O2*的发酵上清液对根结线虫7d卵孵化的抑制率可达50.9％，发酵上清液对二龄幼虫24h的致死率可达到86.5％；室内盆栽试验结果表显示，XZ-O2*发酵菌液处理组的豌豆根系根结数明显减少，60天后防效可达58.25％。在豌豆根结线虫病的大田试验中，120天后XZ-O2*处理组的豌豆根系根结数明显减少，对根结线虫病的防效高达58.97％。

3. XZ-O2*的发酵上清液对豌豆生长的试验中，XZ-O2*菌株对豌豆有较好的促生作用，在株高、根长、根部鲜重方面均与对照组均有差异显著(5％水平上)。

4.本发明使用的菌株对根结线虫病防效较高，对人畜无毒；成本低。

5.本发明利用萎缩芽孢杆菌XZ-O2*菌株的发酵菌液直接防治根结线虫病，生产和使用均十分简单，生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过程中和产品中的污染，也不会产生溶剂中毒，具有生物农药对人畜安全的优点。

附图说明

图1为菌株XZ-O2*在牛肉膏蛋白胨平板上的菌落形态、革兰氏染色图片。

图2为盆栽试验中XZ-O2*处理组与清水对照组60天豌豆根系图片。

图3盆栽试验中XZ-O2*处理组与清水对照组60天豌豆植株图片。

图4田间试验中XZ-O2*处理组与清水对照组120天豌豆植株图片。

图5田间试验中XZ-O2*处理组与清水对照组120天豌豆根系图片。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。本发明所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

XZ-O2*菌株的分离及鉴定

1.1 XZ-O2*菌株的分离

申请人从中国西藏自治区土壤土样中分离、筛选得到一株对根结线虫具有较强防治效果的菌株，将其命名为XZ-O2*。本发明的XZ-O2*菌株的分离和纯化采用稀释涂布平板法、平板划线、生物测定等方法。

1.2菌株的鉴定

1.2.1菌株的形态学鉴定

通过观察菌落的颜色、形态、边缘、透明度、光泽度、培养基的颜色等，并通过革兰氏染色观察菌体形态特征。

将XZ-O2*菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线培养，从图1中可以看到：XZ-O2*菌落乳白色、不透明、菌落中部塌陷有褶皱、菌落无光泽、边缘不整齐，后期可产生色素，培养基变褐色。镜检发现菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，有芽孢，上述形态特征表明菌株XZ-O2*属于芽孢杆菌属。

1.2.2菌株生理生化特征检测

采用酶试验、药物敏感试验、氨基酸水解试验、6.5％NaCl生长耐受试验、尿素水解试验等生理生化实验测定。

XZ-O2*部分生理生化实验结果如表1。结果表明，细菌菌株XZ-O2*生理生化特征与芽孢杆菌属生理生化特征基本相似。

表1 XZ-O2*部分生理生化特征

注：“+”表示阳性，“—”表示阴性。

1.2.3菌株XZ-O2*的分子鉴定

将XZ-O2*无菌操作台中接种环挑取单菌落于分装好的NA液体培养基中，35℃，180rpm条件下震荡培养12h，并利用细菌16SrDNA区细菌鉴定的通用引物：27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492r(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行菌液PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃30s、55℃30s、72℃45s，30个循环，72℃10min，4℃保存。PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送生工公司测序。

经测序获得菌株XZ-O2*的16S rDNA序列大小为1453bp(SEQ ID NO.1所示)，通过Blast分析，选取与之同源性较高的菌株，利用软件MEGA5.20进行系统发育分析、NJ法构建菌株的16S rDNA系统发育树。结果表明XZ-O2*与Bacillus atrophaeus聚在一个分支上，统计支持率为100％，结合之前形态特征和生理生化实验，将XZ-O2*鉴定为萎缩芽孢杆菌。

该菌株已于2016年9月5日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Bacillus atrophaeus XZ-O2*；保藏编号：CCTCC NO：M 2016459；地址：中国武汉武汉大学。

培养XZ-O2*菌株使用的是NA培养液，其组分及配方如下：蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

摇瓶发酵参数条件：用挑针挑取细菌单个菌落，接种于装有150mL NA培养液的三角瓶中，35℃，160rpm，摇培72h。将细菌菌液分装入离心管中，8000r/min离心3min，将菌体与上清液分开，上清液过0.22μm的细菌过滤器，收集至另一离心管中。用于实施例2和实施例3。

实施例2：

XZ-O2*菌株发酵上清液对根结线虫卵孵化的影响

将XZ-O2*的上清液加入24孔板中，每孔中加入700μL,然后取100个根结线虫卵与细菌上清液均匀混合，重复三次，设置无菌水为对照；将24孔板放置在25℃恒温箱中，7天后于体式显微镜下观察，计数，并计算根结线虫卵孵化率与相对抑制率。

表2 XZ-O2*发酵上清液对根结线虫卵孵化的影响(7d，25℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)

XZ-O2*菌株发酵上清液对根结线虫卵孵化的结果显示：以ddH2O为对照组的CK在7天后卵的孵化率达到了86.5％，但是经XZ-O2*发酵上清液处理的卵孵化率仅为42.4％，显著抑制了根结线虫卵的孵化(P≤0.05)，相对抑制率可达到50.9％(表2)，说明XZ-O2*菌株发酵上清液能够有效的抑制根结线虫卵的孵化。

实施例3：

XZ-O2*菌株发酵上清液对根结线虫二龄幼虫的影响

将XZ-O2*的上清液加入24孔板中，每孔中加入700μL，同时加入100条根结线虫二龄幼虫与上清液均匀混合，重复三次，同时设置无菌水作为对照参考，将24孔板放置在25℃恒温箱中，分别在12h与24h后于体式显微镜下观察，并记录结果。

表3 XZ-O2*发酵上清液对根结线虫二龄幼虫的影响(25℃)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)

XZ-O2*菌株发酵上清液对根结线虫二龄幼虫的影响实验结果显示：经过ddH₂O处理后12h，24h的二龄幼虫死亡率均为0，XZ-O2*菌株发酵上清液处理组在处理后12h和24h后，对二龄幼虫致死的死亡率分别为83.3％和86.5％(表3)。实验证明XZ-O2*菌株发酵上清液对根结线虫二龄幼虫具有非常好的致死效果。

实施例4：

XZ-O2*菌株防治豌豆根结线虫的温室盆栽试验

供试材料和方法：

豌豆：中豌六号

线虫：南方根结线虫Meloidogyne incognita

豌豆种子浸泡7-8个小时后播种于口径为18cm、高为11cm的营养钵中，每营养钵1.5kg无线虫土壤，出苗后每个营养钵留一棵豌豆苗。

XZ-O2*液体发酵培养：发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基(溶剂为水，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。)。挑取XZ-O2*单菌落接种到装有150mL NA液体培养基的三角瓶中，35℃，160rpm，摇培72h，得到XZ-O2*发酵液。该XZ-O2*发酵液中，芽孢杆菌XZ-O2*的含量为2×10 ⁹cfu/mL。

试验设如下两个处理：

XZ-O2*处理组：待豌豆幼苗苗长出4片真叶后接种南方根结线虫：将培养好的南方根结线虫配制成100条/mL的线虫悬浮液，取10mL均匀加入植株根系周围。同时在当天进行发酵液处理，用2×10⁹cfu/mL的XZ-O2*发酵液10mL灌根处理豌豆幼苗。试验设3次重复，每个重复处理8株豌豆幼苗。然后放置在温室中进行培养。培养30天后补施一次发酵液，正常田间管理。

对照组：将XZ-O2*发酵液替换为等量的清水，其它实验操作与XZ-O2*处理组相同。

病害调查：分别距离第一次施药60d进行病害调查，拍照记录。①豌豆生长情况的调查：测量并统计株高、地上部分鲜重(不含果实)、根部长度、根部鲜重等数据。②豌豆根结线虫病发病情况调查：将豌豆植株的根剪下，将每组各处理的根收集在一起，剪碎并在榨汁机中打浆2次，第1次10s，第2次20s，先后用200目、325目的筛子过滤，蒸馏水冲洗筛子，收集留在325目筛子上的线虫和卵；各处理每组各取1mL的悬液，置于自制的双层玻片中观察，对其中的根结线虫与根结线虫卵进行计数，并计算每棵豌豆根部中根结线虫和根结线虫卵的数量。

防治效果＝(对照组根结数—处理组根结数)/对照组根结数×100％

表4 XZ-O2*发酵液对豌豆生长情况的影响(60d)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)

豌豆生长情况的调查结果表明：在第一次药剂处理后60天时对豌豆幼苗生长指标进行统计分析时发现XZ-O2*处理组的所有生理指标均高于与CK组，并且在0.05水平上存在显著性差异(表4)。试验证明XZ-O2*发酵液对豌豆生长有显著地促进作用。

表5.盆栽试验中XZ-O2*发酵液对根结线虫的防治效果(60d)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)

XZ-O2*发酵液对根结线虫的防治效果证明：XZ-O2*液体发酵培养物在没有任何助剂填加的条件下，施用2次，60天后对豌豆根结线虫病防效仍达58.25％(表5)。经XZ-O2*处理后的豌豆苗根系发达，根结少，植株生长正常，未发现明显的药害，对豌豆安全，具有良好的应用价值。

实施例5：

XZ-O2*菌株防治豌豆根结线虫的田间试验

供试材料和方法：

豌豆：中豌六号

线虫：南方根结线虫Meloidogyne incognita

豌豆种子播种于线虫病害较为严重的温室大棚(华中农业大学实验农场，武汉)，每陇3行，每行6穴。出苗10d后间苗，每穴留一株豌豆幼苗。

XZ-O2*液体发酵培养：发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基(溶剂为水，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，牛肉膏3g，补充蒸馏水至1000mL，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。)。挑取XZ-O2*单菌落接种到装有150mL NA液体培养基的三角瓶中，35℃，160rpm，摇培72h，得到XZ-O2*发酵液。该XZ-O2*发酵液中，芽孢杆菌XZ-O2*的含量为2×10 ⁹cfu/mL。

试验设如下两个处理：

XZ-O2*处理组：播种豌豆种子30d后，进行发酵液处理，用2×10⁹cfu/mL的XZ-O2*发酵液10mL灌根处理豌豆幼苗。1陇即一个重复，每陇共18株豌豆，试验设3次重复，每个重复处理1陇豌豆幼苗，保持正常田间管理。

清水对照组(CK)：将XZ-O2*发酵液替换为等量的清水，其它实验操作与XZ-O2*处理组相同。

病害调查：120d后，对豌豆生长情况和发病状况进行调查和拍照记录，并进行数据统计分析。①豌豆生长情况的调查：测量并统计株高、地上部分鲜重(含果实)、根部长度、根部鲜重等数据。②豌豆根结线虫病发病情况调查：将豌豆根系用清水轻轻冲洗干净后，

观察根系发病情况，对病害进行分级。

病害分级：

0级：无根结；

1级：有少数根结，占全根系1％-25％；

2级：根系根结数量中等，占全根系的26％-50％；

3级：根系根结数量多，占全根的51％-75％；

4级：根系根结数量很多，占全根系76％-100％

防治效果＝(对照组根结级数—处理组根结级数)/对照组根结级数×100％

表6田间试验中XZ-O2*发酵液对豌豆地上部分生长的影响(120d)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)

豌豆地上部分生长情况的调查证明：调查120d后豌豆苗的地上部分鲜重(含果实)、株高、单株豆荚数、单株豆荚重，并利用SPSS 17.0进行数据统计分析发现，XZ-O2*处理组的各项生长指标均明显高于清水处理组(CK)，并且在0.05水平上存在显著性差异(表6)。

表7 XZ-O2*发酵液对豌豆根结线虫的田间防治效果(120d)

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检验，P≤0.05)

XZ-O2*发酵液对豌豆根结线虫的田间防治效果证明：120d后对豌豆地下部分鲜重和根长测量统计，并对根结进行病害分级，并利用SPSS 17.0进行数据统计分析发现，XZ-O2*处理组的地下部分鲜重和根长明显高于清水处理组(CK)，并且在0.05水平上存在显著性差异；XZ-O2*处理组的单株根结病害级数相对于清水处理组(CK)也显著下降，XZ-O2*发酵液对于豌豆根结线虫的防治效果可达到58.97％(表7)。经XZ-O2*处理后的豌豆苗根系发达，根结少，植株生长正常，未发现明显的药害(图4，图5)，对豌豆安全，具有良好的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一株防治植物根结线虫的萎缩芽孢杆菌及其应用

<130> 一株防治植物根结线虫的萎缩芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1453

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgttgcggg tgctatacat gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat gcttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180

cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aatggctcac 240

caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360

gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420

acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540

taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600

ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960

cttgacatcc tctgacaccc ctagagatag ggcttcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200

gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg agaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260

ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa 1440

ggtgacagag tgg 1453