固氮鱼腥藻细胞受ALS抑制剂类除草剂损伤的修复方法与流程

本发明涉及生物技术，尤其是涉及一种固氮鱼腥藻细胞受ALS抑制剂类除草剂损伤的修复方法。

背景技术：

近年来，随着除草剂、氮肥等农用化学品的大量使用，给农业带来高效生产的同时，也给农业生态环境造成极大的危害。农业面源污染已成为世界范围内亟需解决的问题，含氮化肥及除草剂造成的地表水体污染及富营养化，会对人体及生态环境带来大量负面影响。另外，大量使用除草剂和氮肥使土壤板结严重化，不仅影响到到农作物的产量，还将关系到国泰民安等重要民生问题。我国18亿亩耕地资源十分宝贵，据统计我国的人均耕地面积为1.3亩，预计到2030年，人均耕地面积将再减少25％。因此，保护农业生产环境，对人类的健康生活具有重要的保障，是农业可持续发展的重要基础。

历史证明，大量使用除草剂对生态环境、对人体健康会造成重大影响，尤其是三致——致癌、致畸、致突变等健康问题，引起了人们的广泛关注和高度重视。ALS抑制剂类除草剂是20世纪80年代开发的绿色化学除草剂，不仅使用剂量超低，而且人及哺乳动物体内不含其靶标ALS酶，因而其对人和动物安全。ALS抑制剂类除草剂高效、安全，在世界范围内广泛使用，是目前世界销量第一的除草剂，使除草剂从低剂量阶段发展至超高效阶段，是除草剂发展史上的里程碑，成为近年来也是未来除草剂新品种开发的热点。

固氮鱼腥藻是我国农田中的优质微生物资源,生长繁殖快、分布广，不含藻毒素，能将空气中的氮素转化为有机氮，是天然的氮肥，不污染水体环境，生长繁殖迅速，能快速铺满水层表面，吸收环境中的有害物质，有效抑制杂草萌发生长；其藻体沉入土壤被分解后，能增加土壤肥力、改善土壤结构，而且其特有的藻促生长素能促进作物茁壮生长，能使水稻等作物增产10％—30％。因此，固氮鱼腥藻在改善土壤、生物控草、促进作物健康生长等方面具有显著效果，能有效减少农田农药与化肥的使用，是生态修复最优质的天然资源之一。此外，近年来固氮鱼腥藻在精细化学品、保健品、清洁能源等方面的用途备受青睐，也具有很大的开发潜力。

固氮鱼腥藻在农田中的作用显而易见，然而，固氮鱼腥藻具有与高等植物相似的光合系统及靶标ALS酶，ALS抑制剂类除草剂在防除杂草的同时，会对农田的固氮鱼腥藻产生致命的杀伤性，使其面临灭绝的险境，这也是使土壤的贫瘠化的主要因素之一。但至今，在世界范围中未发现有关于固氮鱼腥藻受ALS抑制剂类除草剂损伤修复的方法的报道，致使固氮鱼腥藻在ALS抑制剂类除草剂的大量使用下，被动地承受大量地伤亡，甚至灭亡。因此，如何将受到ALS抑制剂类除草剂损伤的固氮鱼腥藻细胞进行修复，以恢复其活力，是摆在科技工作者面前的重要任务。

技术实现要素：

本发明的目的，就是为了提供一种固氮鱼腥藻细胞受ALS抑制剂类除草剂损伤的修复方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种固氮鱼腥藻细胞受ALS抑制剂类除草剂损伤的修复方法是，配制一种由MgSO₄、KNO₃、钼酸、蔗糖组成的修复剂，在使用ALS抑制剂类除草剂1—3天内，将修复剂以1:100的体积比加入到受损的固氮鱼腥藻细胞液中，连续培养7天，促进固氮鱼腥藻细胞光合色素的合成，提高其抗氧化酶系统的活性，恢复其生长活力。

所述修复剂中各物质的浓度如下：钼酸：0.05g/L；蔗糖：15g/L，MgSO₄：10—30g/L；KNO₃：20—40g/L。

上述的固氮鱼腥藻细胞受ALS抑制剂类除草剂损伤的修复方法具体包括以下步骤：

1)配制修复剂

分别称取一定重量的钼酸、蔗糖、MgSO₄和KNO₃加入水中，并控制各物质的终浓度为：钼酸：0.05g/L；蔗糖：15g/L，MgSO4：10—30g/L；KNO3：20—40g/L；

2)在使用ALS抑制剂类除草剂后1—3天内，将修复剂以1:100的体积比加入固氮鱼腥藻细胞液中；

3)在加入修复剂后，用NaOH和盐酸调节pH为7.8，连续培养7天。

本发明通能减少ALS抑制剂类除草剂对固氮鱼腥藻的不利影响，有效地修复受损固氮鱼腥藻细胞，促进固氮鱼腥藻细胞光合色素的合成，提高其抗氧化酶系统的活性，恢复其生长活力，发挥其改善土壤结构、减少农药使用，维持生态平衡等方面的作用，达到保护生态资源、可持续管理的目的。

附图说明

图1是加入含不同MgSO₄浓度的修复剂7天后对固氮鱼腥藻的生长状况的影响；

图2是加入含不同MgSO₄浓度的修复剂7天后对固氮鱼腥藻细胞数的影响；

图3是加入含不同MgSO₄浓度的修复剂7天后对固氮鱼腥藻光合色素的影响；

图4是加入含不同MgSO₄浓度的修复剂7天后对固氮鱼腥藻抗氧化酶活性的影响；

图5是加入含不同KNO₃浓度的修复剂7天后对固氮鱼腥藻的生长状况的影响；

图6是加入含不同KNO₃浓度的修复剂对固氮鱼腥藻的生长状况的影响；

图7是加入含不同KNO₃浓度的修复剂7天后对固氮鱼腥藻光合色素的影响；

图8是加入含不同KNO₃浓度的修复剂7天后对固氮鱼腥藻抗氧化酶活性的影响。

具体实施方式

本发明以ALS抑制类除草剂中开发应用历史最悠久、销量最广、最具代表性的苄嘧磺隆为案例。研究表明，苄嘧磺隆在常规田间用量下(有效0.08mg/L)，使其细胞生长受到一定的抑制作用，使抗氧化酶系统活性下将，固氮鱼腥藻细胞呈现黄绿色，甚至解体。考虑到苄嘧磺隆在田间生产可能被不恰当的过量使用，故本发明使用的苄嘧磺隆的剂量高于常规田间应用剂量的25％(有效成分0.1mg/L)。以一定浓度比例的MgSO₄、KNO₃、钼酸、蔗糖混合液为修复剂，调节PH为7.8，在使用0.1mg/L苄嘧磺隆后1—3天内，以1:100的体积比加入到受损的固氮鱼腥藻细胞液中，连续培养7天，促进固氮鱼腥藻细胞光合色素的合成，提高其抗氧化酶系统的活性，恢复其生长活力。

上述方法具体包含以下步骤：

1)在使用0.1mg/L苄嘧磺隆后1—3天内，以1:100的体积比在固氮鱼腥藻细胞液中加入一定浓度比例的MgSO₄、KNO₃、钼酸、蔗糖组成的修复剂，MgSO₄浓度范围为10—30g/L，KNO₃浓度范围为20—40g/L，钼酸为0.05g/L，蔗糖为15g/L。

2)在加入修复剂后，用NaOH和盐酸调节pH为7.8。连续培养7天，并控制培养温度为(30±2)℃，光暗比为16h∶8h，光照强度为(3 000±200)lx。

以下通过几个实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

实施时间：2016年4月至2016年5月

试验方案：本试验有8种处理，空白对照CK处理组(不加苄嘧磺隆及修复剂)，加药对照处理组(加入0.1mg/L苄嘧磺隆，不加修复剂)，其他6个处理组加0.1mg/L苄嘧磺隆后第3天时，以1:100的体积比分别加入MgSO₄浓度为10、20、30、40、50、60g/L的修复剂，其他成分一样，KNO₃浓度为20g/L，钼酸为0.05g/L，蔗糖为15g/L。每个处理重复3次。

1)在加入0.1mg/L苄嘧磺隆处理固氮鱼腥藻细胞培液第3天时、6个处理组分别以1:100的体积比加入MgSO₄浓度为10、20、30、40、50、60g/L的修复剂，其他成分一样，KNO₃浓度为20g/L，钼酸为0.05g/L，蔗糖为15g/L。

2)在加入修复剂后，用NaOH和盐酸调节pH为7.8。连续培养7天，培养温度(30±2)℃，光暗比16h∶8h，光照强度(3 000±200)lx。

3)如图1所示，第7天时，加药对照处理组固氮鱼腥藻藻体呈黄绿色，而10、20、30g/L处理组与CK处理组的固氮鱼腥藻生长状态相似，藻体都呈深蓝绿色浮在水中，水面有气泡，藻细胞生长良好。如图2所示，第7天时，加药对照处理组与CK处理组的细胞数相比减少了25.73％；10、20、30、40、50、60g/L处理组与加药对照处理组相比，细胞数分别增加了25.50％、27.14％、26.09、11.18％、2.38％、2.91％，说明10、20、30g/L处理组使细胞数增长的作用显著，使其恢复至CK处理组的93.21％—94.43％。如图3所示，第7天时，加药对照处理组光合色素含量与CK处理组相比减少了49.29％—51.65％；40、50、60g/L处理组光合色素含量与加药对照处理组相比增加了18.042—22.39％，而10、20、30g/L处理组的光合色素含量与加药对照处理组相比增加了58.03％—62.39％，使固氮鱼腥藻光合色素含量增长显著，达到CK处理组光合色素含量的90.66％—92.85％。如图4所示，加药对照处理SOD、POD、CAT活性与CK处理组相比减少了21.93％—45.11％；而10、20、30g/L处理组酶活性比加药对照处理组高31.75％—91.92％，与CK处理组酶的活性接近，说明抗氧化酶活性恢复至正常值。

由此可见，加入MgSO₄浓度为10—30g/L的修复剂，能起到明显的修复固氮鱼腥藻细胞的作用，促进光合作用，激活酶的活性，增强细胞生长活力。

实施例2

实施时间：2016年5月到2016年7月

试验方案：本试验有8种处理，空白对照CK处理组(不加苄嘧磺隆及修复剂)，加药对照处理组(加入0.1mg/L苄嘧磺隆，不加修复剂)、其他6个处理组加0.1mg/L苄嘧磺隆后第3天时，以1:100的体积比分别加入KNO₃浓度为10、20、30、40、50、60g/L的修复剂，其他成分一样，MgSO₄浓度为30g/L，钼酸为0.05g/L，蔗糖为15g/L。每个处理重复3次。

1)在加入0.1mg/L苄嘧磺隆处理固氮鱼腥藻细胞培液第3天时，6个处理组以1:100的体积比分别加入KNO₃浓度为10、20、30、40、50、60g/L的修复剂，其他成分一样，MgSO₄浓度为30g/L，钼酸为0.05g/L，蔗糖为15g/L。

2)在加入修复剂后，用NaOH和盐酸调节pH为7.8。连续培养7天，培养温度(30±2)℃，光暗比16h∶8h，光照强度(3 000±200)lx。

3)如图5所示，第7天时，加药对照处理组固氮鱼腥藻藻体呈黄绿色，而20、30、40g/L处理组与CK处理组的固氮鱼腥藻生长状态相似，藻体都呈深蓝绿色浮在水中，水面有气泡，藻细胞生长良好。如图6所示，第7天时，加药对照处理组与CK处理组的细胞数相比减少了25.16％；10、20、30、40、50、60g/L处理组与加药对照处理组相比，细胞数分别增加了1.02％、23.12％、21.20％、22.42％、5.09％、2.91％，说明20、30、40g/L处理组使细胞数增长的作用显著，使其恢复至CK处理组的95.43％—97.31％。如图7所示，第7天时，加药对照处理组光合色素含量与CK处理组相比减少了50.12％—52.65％；10、50、60g/L处理组光合色素含量与加药对照处理组相比增加了15.46—22.04％，而20、30、40g/L处理组的光合色素含量与加药对照处理组相比增加了41.25—43.60％，使固氮鱼腥藻光合色素含量增长显著，达到CK处理组光合色素含量的89.54％—92.66％。如图8所示，加药对照处理组OD、POD、CAT活性与CK处理组相比减少了24.96％—46.69％；而20、30、40g/L处理组酶活性比加药对照处理组高6.35％—14.63％，与CK处理组酶的活性接近，说明抗氧化酶活性恢复至正常值。

由此可见，加入KNO₃浓度为20—40g/L的修复剂，能起到明显的修复固氮鱼腥藻细胞的作用，促进光合作用，激活酶的活性，增强细胞生长活力。