本发明属于农业微生物
技术领域：
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122在制备淀粉酶、抗细菌药物和饲料添加剂中的应用。
背景技术：
：：在过去的几十年中，饲用抗生素的使用对养殖业的发展做出了突出的贡献，同时，养殖业滥用抗生素导致食品安全和环境问题频发。因此，随着社会和科技的发展，人们对食品安全越来越重视，减少饲料中抗生素的使用是大势所趋。养殖业中滥用抗生素造成负面问题诸多，比如病原菌耐药性产生、动物机体抵抗力下降、疫病频发和肉类品质下降等等，导致饲料用药及治疗用药量越来越高，并且过量使用抗生素容易导致动物生产能力降低。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，其在自然界广泛分布，所产孢子能分泌许多种酶类物质和生长因子，稳定性极好，同时具有耐氧化、抗挤压、耐高温、耐酸等特征，有望成为一种环境友好型饲用微生物。饲料级微生物添加剂是近年来发展起来的一类新型饲料添加剂，研究表明其在提高饲料利用率，增加生产性能，调节肠道微生态平衡，增强免疫力等方面具有显著的促进作用。目前在饲料及动物生产上使用较多的微生物有乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌及光合细菌，其中芽孢杆菌因其具有抗逆性强、耐高温高压、耐酸碱胆盐、易贮存等独特的生物学特性，从动物生产和饲养工业角度来说，芽孢杆菌比其它微生物添加剂具有更大的优势，能更好地满足饲用微生物现代工业生产的要求。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的芽孢杆菌之一，一方面，由于其具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素、促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病和促进生长等方面起到重要作用，已被越来越多的研制成微生物制剂。另一方面，其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，现已在畜牧业、饲料行业中有望成为部分替代抗生素，显示出了重要的社会效益和生态效益。技术实现要素：：本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122在制备淀粉酶中的应用，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122，该菌于2016年8月30日保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：GIM1.1122。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122的生物学特征如下：1、菌株形态特征：菌株在NA培养基平板上培养24小时后的菌落呈白色，圆形，表面光滑不透明，边缘缺刻；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，具有端生鞭毛，运动，无夹膜，芽孢中生，椭圆形。2、生理生化特征：本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122V-P试验为阴性；吲哚试验为阴性；硝酸盐还原阳性；柠檬酸盐利用阳性；碳源产酸中的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖为阳性；能水解淀粉、明胶、七叶苷。生长温度范围20～55℃，最适pH为6.5～7.5。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122的分子分类学地位：提取枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122的基因组DNA并对其16SrDNA进行测序，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122与菌株BacillussubtilisNBRC13719亲缘关系最近。因此，确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122。本发明的第二个目的是提供上述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122在制备抗细菌药物中的应用。优选，所述的抗细菌药物为抗金黄色葡萄球菌药物。本发明的第三个目的是提供上述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122在制备饲料添加剂中的应用。本发明的第四个目的是提供一种饲料添加剂，其特征在于，以上述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122作为活性成份。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122能够产生淀粉酶，经摇瓶发酵培养48小时后，淀粉酶活性达15.23U/mL；抑菌试验表明其对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用；经耐受性试验表明其能耐酸达到pH2.5，耐胆盐能力为0.6g/mL，能很好的在肠道中生存。因此，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122可作为饲用微生物，应用于饲料添加剂的生产。本发明的实现，为研究与开发新的抗菌药物和饲料添加剂提供了候选原料，在抗菌药物和饲料添加剂产业方面具有广泛的应用前景和重要作用。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122于2016年8月30日保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为：GIM1.1122。附图说明：图1是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122的透射电子显微镜照片(6000倍)；图2是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122依据16SrDNA序列构建的系统发育树；图3是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122水解淀粉效果图；图4是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122抑制金黄色葡萄球菌的效果图。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。实施例1：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122的生物学性状及生理生化和分子鉴定S1.1形态特征枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122在NA培养基平板上培养24小时后，菌落白色，圆形，表面光滑不透明，边缘缺刻；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，具有端生鞭毛，运动，无夹膜，芽孢中生，椭圆形(透射电子显微镜照片见图1)。S1.2生理生化特征经生理生化测定，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122V-P试验为阴性；吲哚试验为阴性；硝酸盐还原阳性；柠檬酸盐利用阳性；碳源产酸中的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖为阳性；能水解淀粉、明胶、七叶苷。生长温度范围20～55℃，最适pH为6.5～7.5，结果见表1。表1.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122生理生化特征注：+，阳性；－，阴性；WH，白色；R，杆状S1.3枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122的16SrDNA的序列测定与分析S1.3.1DNA模板的快速准备：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122划线接种在NA培养基平板上，37℃培养24小时。取单一菌落悬浮于10μL无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为DNA模板。S1.3.216SrDNA基因PCR扩增引物：PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；PrimerB：5’-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’。PCR反应体系如表2所示：表2.PCR反应体系10×PCR缓冲液5μL2mmol/LdNTP4μL10pmol/LPrimerA1μL10pmol/LPrimerB1μL2U/LTap酶0.4μLDNA模板1μL灭菌ddH2O37.4μL总体积50μLPCR扩增条件：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环；72℃，7min。S1.3.3序列测定：PCR产物纯化后，测序，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16SrDNA序列，构建系统发育树，如图2所示。经比较发现，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122与菌株BacillussubtilisNBRC13719亲缘关系最近。因此，确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122。实施例2：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122水解淀粉试验淀粉培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，可溶性淀粉2.0g，琼脂20.0g，水1000mL；pH7.2±0.2。卢戈氏碘液：碘1.0g，碘化钾2.0g，水300mL。先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。将灭菌好的淀粉培养基冷却至45℃左右开始倒平板，待平板冷却凝固后倒置于37℃恒温培养箱中放置24小时，目的是控干培养基表面水分和验证平板没有污染杂菌。将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122点接于干燥且无菌的淀粉培养基平板上，倒置放置于37℃培养箱中培养24小时。将卢戈氏碘液均匀添加到平板表面，观察菌落周围水解圈情况，结果见图3。从图3中可知，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122菌落周围均出现了无色水解圈，说明淀粉培养基中的可溶性淀粉已经被水解，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122能够产生淀粉酶。实施例3：淀粉酶活力测定营养肉汤培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，水1000mL。可溶性淀粉溶液(20g/L)：称取2.000g(精确到0.001)于烧杯中，加少量水调成奖状物，边搅边拌加入到70mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却后加水定容至100mL。现配现用。原碘液：称取碘11g，碘化钾22g，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加水定容至500mL，置于棕色瓶中保存。稀碘液：吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，置于棕色瓶中保存。磷酸缓冲液(pH6.0)：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000mL。现配现用。将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122于营养肉汤培养基中37℃摇瓶发酵48小时后，离心取发酵上清液。取20mL可溶性淀粉溶液于试管中，再加入磷酸缓冲溶液5mL混合均匀后，置于60℃恒温水浴锅中预热8分钟。加入1mL发酵上清液，立即计时，摇匀反应5分钟。立即用移液器吸取1mL反应液加入到预先盛有0.5mL盐酸和5mL稀碘液的试管中，并以0.5mL盐酸和5mL稀碘液为空白。于600nm波长下用10mm比色皿迅速测其吸光度(A)，从而计算出上清液淀粉酶浓度。经过三次重复实验，上清液的淀粉酶酶活达到15.23U/mL。实施例4：抑菌试验将常见的病原菌(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌，沙门氏菌)用营养肉汤培养好后，混入到灭菌好冷却到45℃左右的营养琼脂中，混匀后倒平板，待平板冷却凝固后用打孔器在上面打孔，整个过程保证无菌操作。然后将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122的发酵液加入到孔中，不要溢出。小心置于37℃培养箱中培养24小时，观察其现象，若孔洞周围的病原菌不能生长，说明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122能对该种病原菌有抑制作用。经抑菌试验，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，见图4。实施例5：耐酸性试验以营养肉汤培养基(与实施例3的营养肉汤培养基配方相同)配方为基础，用稀盐酸调节pH，使pH分别为1.5，2.5，3.5，4.5四个梯度，将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122接种于营养肉汤培养基中，培养24小时。观察其生长情况，若能生长，说明能耐受该pH值。经耐酸性试验，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122能在pH2.5的环境中生存。实施例6：耐胆盐试验在营养肉汤培养基(与实施例3的营养肉汤培养基配方相同)中，添加牛胆盐，使其浓度分别为0.3g/100mL，0.4g/100mL，0.5g/100mL，0.6g/100mL四个梯度，将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122接种于营养肉汤培养基中，培养24小时后，观察其生长情况，若能生长，说明能耐受该浓度胆盐值。经耐胆盐试验，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122能耐受0.6g/100mL的胆盐能力，完全能适应动物肠道0.3g/100mL的胆盐环境中。综上所述，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122能够产生淀粉酶，经摇瓶发酵培养48小时后，淀粉酶活性达15.23U/mL；抑菌试验表明其对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用；经耐受性试验表明其能耐酸达到pH2.5，耐胆盐能力为0.6g/mL，能很好的在肠道中生存。因此，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)1.1122可作为饲用微生物，应用于饲料添加剂的生产。本发明的实现，为研究与开发新的抗菌药物和饲料添加剂提供了候选原料，在抗菌药物和饲料添加剂产业方面具有广泛的应用前景和重要作用。当前第1页1 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