一种罗丹明‑双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN及其制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺反应型荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

反应型荧光探针通过化学反应直接改变探针分子的结构，引起其光谱信号的明显改变，从而实现光学传感和目标物识别。罗丹明-萘酰亚胺类双基团荧光化合物是制备反应型荧光探针的理想材料，其灵敏度高，选择性强，在离子识别、细胞成像、荧光传感器、生物荧光标记等领域具有极为重要应用前景。

2008年，Zhou等报道了荧光共振能量转移的罗丹明-萘酰亚胺铬离子荧光探针(Zhiguo Zhou,Mengxiao Yu,Hong Yang,Kewei Huang,Fuyou Li,Tao Yi and Chunhui Huang.FRET-based sensor for imaging chromium(III)in living cells.Chemical Communication,2008,3387–3389)；2011年，Kumar等报道了跨键能量转移的罗丹明-萘酰亚胺汞离子探针(Manoj Kumar,Naresh Kumar,Vandana Bhalla,Hardev Singh,Parduman Raj Sharma,and Tandeep Kaur.Naphthalimide Appended Rhodamine Derivative:Through Bond Energy Transfer for Sensing of Hg²⁺Ions.Organic Letters,2011,13(6),1422-1425)；2013年Chereddy等报道了荧光共振能量转移的罗丹明-萘酰亚胺铁离子荧光探针(Narendra Reddy Chereddy,Sathiah Thennarasu，Asit Baran Mandal.A highly selective and efficient single molecular FRET based sensor for ratiometric detection of Fe³⁺ions.Analyst,2013,138,1334–1337)；2014年，Hu等报道了基于荧光共振能量转移-光诱导电子转移机制的罗丹明-4-羟乙基哌嗪萘二甲酰亚胺铬离子荧光探针(Fangzhi Hu,Baozhan Zheng,Dongmei Wang,Maoping Liu,Juan Du and Dan Xiao.A novel dual-switch fluorescent probe for Cr(III)ion based on PET–FRET processes.Analyst,2014,139,3607–3613).设计开发高效灵敏的新型罗丹明-萘酰亚胺反应型荧光探针是近年来的研究热点。

技术实现要素：

本发明提供了一种罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针及其制备方法和应用。本发明将罗丹明荧光团和4-双(2-吡啶甲基)氨基-1,8-萘酰亚胺荧光团通过乙基相连，通过反应型荧光探针和基于非键合的超分子相互作用传统荧光探针的组合设计，得到一种新型罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN。该荧光探针选择性强，灵敏度高，荧光性能优异，可作为比率型荧光探针用于Fe³⁺及Hg²⁺金属离子的灵敏检测，并且REPN具有很强的聚集诱导发光性质，可用于水溶性荧光纳米微球的制备，在荧光探针、荧光传感器、生物荧光分析、细胞染色及荧光成像、药物高通量筛选、环境监测等领域具有极其重要的应用价值。

本发明提供了一种罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN，由如下结构式构成：

上述的罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN的制备方法，由4-双(2-吡啶甲基)氨基-1,8-萘二甲酸酐与罗丹明-乙基胺通过酸酐氨解反应制备得到。

所述的4-双(2-吡啶甲基)氨基-1,8-萘二甲酸酐是由4-溴-1,8-萘酐与双(2-吡啶基甲基)胺在2-甲氧基乙醇中反应得到。

上述罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN在作为金属离子Fe³⁺和Hg²⁺荧光探针方面的应用。

上述罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN在作为聚集诱导发光材料方面的应用。

上述罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN在作为水溶性荧光纳米微球制备方面的应用。

有益效果：本发明的荧光分子包含罗丹明和4-双(2-吡啶甲基)氨基-1,8-萘酰亚胺复合荧光团，通过罗丹明内酰胺的开环反应、双吡啶基团与金属的配位作用、双吡啶甲基氨基萘酰亚胺与罗丹明之间的分子内荧光共振能量转移、杂原子N与萘酰亚胺的光诱导电子转移、聚集诱导荧光等多重机制灵敏调控探针分子REPN的荧光性能。本发明的荧光探针REPN兼具反应型荧光探针和基于非键合的超分子相互作用传统荧光探针的优点，选择性强，灵敏度高，荧光性能优异。同时REPN具有很强的聚集诱导发光性质，可用于染料负载荧光纳米微球的制备。

附图说明

图1是罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针分子REPN在水/乙醇溶液中(缓冲溶液pH为7.4，水与乙醇的体积比1:1，REPN荧光分子的浓度为10^-5mol/L)分别加入不同种类金属离子(Ag⁺、Li⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺以及Fe³⁺,Hg²⁺,金属离子浓度均为5×10^-5mol/L)的荧光光谱；

图2为罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光分子REPN的固体荧光光谱；

图3为罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光染料REPN负载的二氧化硅荧光纳米微球在纯水中的荧光光谱。

具体实施方式

实施例1罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN的制备方法

4-溴-1,8-萘酐从西亚试剂有限公司购买；2-乙烯基吡啶从阿达玛斯试剂有限公司购买；罗丹明B从天津市化学试剂研究所购买。纯度均为分析纯。

化合物罗丹明-乙基胺(Rh-NH₂)按文献方法制备(Xuan Zhang,Yasuhiro Shiraishi,Takayuki Hirai.Cu(II)-selective green fluorescence of a rhodamine-diacetic acid conjugate.Organic Letters,2007,9(24),5039-5042)。氮气保护下罗丹明B与乙二胺在乙醇中回流反应得到化合物Rh-NH₂。

氮气保护下4-溴-1,8-萘酐(1.00g,3.62mmol)与双(2-吡啶基甲基)胺(1.10g,5.52mmol)在2-甲氧基乙醇(50mL)中反应72h。反应结束后，萃取，蒸馏，柱色谱提纯，得到化合物PN。化合物PN的合成路线如下：

分析所得化合物PN：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃,ppm):δ9.06(d,J＝8.5Hz，1H),8.63～8.66(m,3H),8.41(d,J＝8.2Hz，1H),7.78(t,J＝7.8Hz,1H),7.69(dd,J₁＝6.4Hz,2H),7.41(d,J＝7.7Hz，2H),7.24～7.32(m,3H),4.85(s,4H).

HRMS Calcd for C₂₄H₁₈N₃O₃[M+H]⁺396.134Found 396.132.

获得的化合物结构式为

罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN的合成路线如下：

氮气保护下将0.46g(0.95mmol)化合物Rh-NH₂溶于40mL无水乙醇中，加入0.41g(1.04mmol)化合物PN，磁力搅拌，回流反应48h，反应结束后，蒸馏浓缩反应液，用柱色谱及重结晶提纯，得到固体REPN，产率72％。

分析所得化合物REPN：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃,ppm):δ8.85(d,J＝5.0Hz，1H),8.61(d,J＝2.6Hz2H),8.54(d,J＝4.3Hz,1H),8.31(d,J＝4.9Hz,1H),7.91～7.92(m,1H),7.68(t,J＝1.8Hz,1H),7.62(t,J＝4.8Hz,2H),7.43(dd,J₁＝1.8Hz,J₂＝1.8Hz,2H),7.37(d,J＝4.7Hz,2H),7.19～7.22(m,3H),7.07～7.09(m,1H),6.56(d,J＝5.2Hz,2H),6.43(s,2H),6.16(d,J＝4.5Hz,2H),4.75(s,4H),4.13(t,J＝3.6Hz,2H),3.54(t,J＝3.5Hz,2H)，3.24～3.28(m,8H)，1.15(t,J＝4.1Hz,12H).

¹³C NMR(CDCl₃,ppm):δ168.38,164.27,163.72,157.44,153.74,153.30,149.50,148.52,136.65,132.10,131.49,130.84,129.82,128.97,127.78,126.58,125.71,123.712,122.88,122.35,117.22,108.02,97.93,59.86,44.28,39.03,12.60.

HRMS Calcd for C₅₄H₅₂N₇O₄[M+H]⁺862.4075Found 862.4078.

获得的化合物结构式为

将实施例1制备的罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN进行实施例2～4的试验，具体数据和分析如下。

实施例2罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN对Fe³⁺和Hg²⁺金属离子的检测

图1是罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光分子REPN在水/乙醇溶液中(pH为7.4，水与乙醇的体积比1:1，REPN荧光分子的浓度为10^-5mol/L)分别加入不同种类金属离子(Ag⁺、Li⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺以及Fe³⁺,Hg²⁺,金属离子浓度均为5×10^-5mol/L)的荧光光谱。分别加入相同浓度不同种类的金属离子Ag⁺、Li⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺时，REPN的荧光峰位于516nm附近，是双吡啶甲基氨基萘酰亚胺的荧光发射，而此时罗丹明处于“off”关闭状态，578nm无荧光发射；当加入相同浓度的Fe³⁺金属离子时，由于Fe³⁺作用下罗丹明螺环打开，荧光处于“on”状态，578nm荧光很强，同时由于REPN中的双吡啶甲基氨基与Fe³⁺螯合配位，抑制了杂原子N对萘酰亚胺的光诱导电子转移(PET)效应，使得516nm的萘酰亚胺荧光峰强度陡增，实验测定REPD与Fe³⁺的配位比是1:2。当加入相同浓度的Hg²⁺金属离子时，由于存在Hg²⁺诱导的荧光共振能量转移，516nm处的萘酰亚胺荧光峰几乎淬灭，而罗丹明的螺环打开荧光处于“on”状态，荧光发射位于578nm。

REPN含有罗丹明和双吡啶甲基氨基萘酰亚胺双荧光团，对金属离子Fe³⁺和Hg²⁺的识别表现出良好的选择性且不受共存金属离子的干扰，存在多重识别机制共存，可实现比率型识别和荧光调控。REPN是灵敏的金属离子Fe³⁺和Hg²⁺荧光探针，可用于环境及生物体中金属离子Fe³⁺和Hg²⁺的检测。

实施例3罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN的固体荧光

图2为罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN的固体荧光光谱。暗室中荧光化合物REPN的固体粉末在紫外灯下发出明亮的黄色荧光，REPN的固态最大荧光发射波长为539nm。REPN在含水量70％～90％的水/有机混合溶剂中荧光较强，最大荧光发射波长位于535nm附近。

罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光分子REPN具有很强的聚集诱导发光特性，可作为聚集诱导发光材料，具有极其重要的应用价值。

实施例4罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN染料负载的水溶性荧光纳米微球的制备方法

保持0℃，在超声反应器中将0.44g二(2-乙基己基)琥珀酸磺酸钠溶于20mL去离子水中，搅拌下加入0.8mL正丁醇，缓慢滴加溶有0.5mg罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光染料REPN的60μL DMF溶液。滴加完毕后继续超声3min，加入0.2mL乙烯基三乙氧基硅烷，室温下搅拌8h，接着滴加20μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷后室温下搅拌24h。反应结束后透析72h得到罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN染料负载的荧光纳米微球,在5℃保存使用。

图3为罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光染料REPN负载的二氧化硅荧光纳米微球在纯水中的荧光光谱，荧光很强，最大发射峰位于495nm。负载罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺REPN染料的二氧化硅荧光纳米粒子易溶于水中，表面富含大量活性氨基，易于修饰，生物相容性好，荧光性质优良，可用于生物荧光分析、药物高通量筛选等生命科学领域。

实例化合物罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN通过罗丹明内酰胺的开环反应、双吡啶基团与金属的配位作用、双吡啶甲基氨基萘酰亚胺与罗丹明之间的分子内荧光共振能量转移、杂原子N与萘酰亚胺的光诱导电子转移、聚集诱导荧光等多重机制灵敏调控探针分子的荧光性能。本发明的罗丹明-双吡啶甲基氨基萘酰亚胺荧光探针REPN选择性强，灵敏度高，荧光性能优异，可作为比率型荧光探针用于Fe³⁺及Hg²⁺金属离子的灵敏检测，并且REPN具有很强的聚集诱导发光性质，可用于染料负载荧光纳米粒子制备。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。