一种灰霉病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法与流程

本发明涉及病原菌抗药性检测
技术领域：
，尤其涉及一种灰霉病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法。
背景技术：
：植物病原菌抗药性，是指病原菌长期在单一药剂或同类药剂选择作用压力下，通过遗传、变异，对此获得的适应性。随着科技的发展，病原菌抗药性的研究成为一个热点问题，现代的分子检测手段日新月异，可以通过核酸水平的分子诊断技术检测杀菌剂的抗药性，但是对于基因组中控制抗性的突变位点不明确的病原菌或不具备抗药性分子检测条件的单位，只能采用传统的病原菌抗药性检测技术。传统的病原菌抗药性检测技术，主要是菌丝生长法、孢子萌发法，需要田间采样，实验室分离纯化，接种到含药培养基或喷洒药剂的植物组织上，这个过程耗时、费力，而且一次性检测数量有限。技术实现要素：发明目的：为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种省时省力、操作方便、无需采样，可就地同时检测多种药剂且快速准确的灰霉病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法。技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种灰霉病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备灰霉病菌检测试剂盒；(2)取样检测：田间取样就地检测；(3)药剂抗药性的判定：根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性；其中所述制备灰霉病菌检测试剂盒具体步骤为确定供测药剂的区分计量、确定供测药剂所需要的培养基种类、确定一次检测的药剂数量、选择培养板、配置培养基、最后加工成为灰霉病菌检测试剂盒。根据供测药剂的数量，所述培养板选择6孔、12孔、24孔、48孔灭菌细胞培养板中的一种。更为优选的，所述培养基的配制根据供测药剂的种类制备不同的培养基。更进一步的，所述培养基的配制具体为在培养基中加入供测药剂母液，配置成所需要的浓度，在无菌工作台上将培养基加入到培养板中，完成后加盖，密封，4℃冰箱保存备用，有效期一个月。更为优选的，所述田间取样以及药剂抗药性的判定的具体操作为，发现病原菌时用无菌独立包装棉签或牙签取样，直接接种到所述检测试剂盒中，加盖，密封保存，带回实验室内23℃恒温培养2d，正常生长即为抗性菌株，否则为敏感菌株。有益效果：本发明提供的一种灰霉病菌对多种药剂抗药性的快速检测方法，通过首先制备灰霉病菌检测试剂盒，然后进行田间取样就地检测，最后根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性的方法对多种药剂的抗药性进行快速检测；克服了传统的病原菌抗药性检测技术需要田间采样，实验室分离纯化，接种到含药培养基或喷洒药剂的植物组织上的耗时费力且一次性检测数量有限的缺陷，具有省时省力、操作方便、无需采样，可就地同时检测多种药剂且快速准确的优点，实用价值和可推广性显著。附图说明图1为本发明实施例1的6孔灭菌细胞培养板示意图；图2为本发明实施例2的12孔灭菌细胞培养板示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：实施例1：A)试验地点：江苏省句容市白兔镇农户草莓大鹏B)试验时间：2016年4月C)试验目的：检测50株草莓灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、乙霉威、吡唑醚菌酯、嘧菌酯5种药剂的抗药性水平。D)实施方法：(1)制备灰霉病菌检测试剂盒：由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所实验室内制备灰霉病菌检测试剂盒：首先确定供测药剂的区分计量和培养基种类(具体见表1)，选取6孔灭菌细胞培养板(见图1)，将灭菌培养基制备成含药培养基，加入到培养板中，每个孔加一种含药培养基，以PDA培养基作为空白对照，其中嘧菌酯和吡唑醚菌酯为防止旁路氧化，培养基中均含有SHAM100mg·L-1，将制备好的检测试剂盒密封，4℃下冰箱保存备用。表1药剂的区分计量和培养基种类(2)取样检测：取50个上述试剂盒，装入整理箱中，带入试验田间；(3)药剂抗药性的判定：在草莓大棚内，用独立包装灭菌棉签或牙签，轻轻的在发病并产生霉层的草莓果实上蘸取病原菌孢子，点在试剂盒内的每一个孔中，加盖密封，每株病原菌接种一个试剂盒；将接种后的试剂盒带回实验室，23℃恒温培养2d，检查结果，根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性，正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。E)试验结果见表2。表2草莓灰霉病菌对5种药剂的抗药性检测药剂名称抗性频率(％)多菌灵90腐霉利92乙霉威82嘧菌酯80吡唑醚菌酯80实施例2：A)试验地点：江苏省句容市老方葡萄园B)试验时间：2016年5月C)试验目的：检测50株葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利、乙霉威、咪鲜胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、嘧霉胺、咯菌腈11种药剂的抗药性水平。D)实施方法：(1)制备灰霉病菌检测试剂盒：由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所实验室内制备灰霉病菌检测试剂盒：首先确定供测药剂的区分计量和培养基种类(具体见表3)，选取12孔灭菌细胞培养板(见图2)，将灭菌培养基制备成含药培养基，加入到培养板中，每个孔加一种含药培养基，以PDA培养基作为空白对照，其中嘧菌酯和吡唑醚菌酯为防止旁路氧化，培养基中均含有SHAM100mg·L-1，将制备好的检测试剂盒密封，4℃下冰箱保存备用。表3药剂的区分计量和培养基种类药剂名称区分计量(ppm)培养基种类多菌灵10PDA腐霉利0.5PDA乙霉威0.5PDA咪鲜胺0.5PDA嘧菌酯10MEA吡唑醚菌酯10MEA啶酰菌胺75YBA氟吡菌酰胺10YBA氟唑菌酰胺5YBA嘧霉胺5CzA咯菌腈0.5CzA(2)取样检测：取50个上述试剂盒，装入整理箱中，带入试验田间；(3)药剂抗药性的判定：在葡萄园内，用独立包装灭菌牙签，轻轻的在发病并产生霉层的葡萄叶片或果梗上蘸取病原菌孢子，点在试剂盒内的每一个孔中或将病菌孢子抖落于每个孔中，加盖密封，每株病原菌接种一个试剂盒；将接种后的试剂盒带回实验室，23℃恒温培养2d，检查结果，根据病原菌是否能够正常生长确定菌株是否产生抗药性，正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。E)试验结果见表4。表4葡萄灰霉病菌对11种药剂的抗药性检测应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。当前第1页1 2 3