基于ITS2序列鉴别大花龙胆与混伪品的引物、鉴别方法与流程

本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种基于ITS2序列鉴别大花龙胆与混伪品的引物、鉴别方法。

背景技术：

大花龙胆G.szechenyii，具有清湿热，泻肝胆实火，镇咳，利喉，健胃等功效，主治肺热咳嗽，目赤咽痛，阴部湿疹，天花等病症，药用部位为其干燥花枝。目前，大花龙胆被归类为白花龙胆的一种，除了大花龙胆，白花龙胆还包括高山龙胆和岷县龙胆。

由于大花龙胆主要来自野生，而且功效有其特殊之处，市场需求量逐年攀升，市场价格远远超过比其他白花龙胆类药材，经济价值高。但是，由于外形相似、分类混乱、鉴定者知识的局限性等原因，目前大花龙胆与其他白花龙胆以及秦艽等龙胆属药材难以区分，导致对大花龙胆的认识存在同物异名、同名异物、品种之间误用混用等问题，严重影响了用药的准确性和安全性。

目前，有关大花龙胆的研究只见零星报道，对大花龙胆的鉴别仍然主要依靠传统的形态分类学鉴定，鉴定工作难度很大。随着分子生物学的发展，分子鉴定方法也越来越多的应用到中药材的鉴定上，但目前还未见使用分子技术对大花龙胆进行鉴别的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于ITS2序列鉴别大花龙胆与混伪品的引物、鉴别方法。

本发明提供了一种鉴别大花龙胆与混伪品的引物对，它是SEQ ID NO:1-2所示的引物对，用于扩增ITS2序列。

本发明还提供了一种鉴别大花龙胆与混伪品的方法，它包括如下步骤：

a、提取待检样本的DNA；

b、基因扩增：采用SEQ ID NO:1-2所示的引物对，对待检样本中的DNA进行PCR，得到PCR产物；

c、结果分析：对步骤b)扩增得到的产物进行测序；对测序结果进行分析即可。

其中，步骤b中，所述PCR的条件为：94℃下变性5min；然后在94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，进行35个循环；72℃延伸10min。

其中，步骤c中，所述对测序结果进行分析的方法为：分析测序结果是否含有SEQ ID NO:3所示的序列；

或者利用遗传分析软件，分析比较待检样本ITS2序列与大花龙胆的ITS2序列差异，判定待检样本是否为大花龙胆。

进一步地，所述遗传分析软件为Mega软件。

本发明还提供了SEQ ID NO:1-2所示的引物对在鉴别大花龙胆与混伪品中的用途。

其中，所述大花龙胆混伪品为高山龙胆、岷县龙胆、高冷龙胆、滇龙胆草、秦艽和/或麻花艽。

大花龙胆混伪品：包括大花龙胆的易混淆品及伪品。

本发明研究发现，大花龙胆的ITS2序列，可以用于鉴别大花龙胆及其混伪品，如岷县龙胆、高山龙胆、高冷龙胆、滇龙胆等，本发明利用ITS2序列鉴别大花龙胆的方法操作简便、准确可靠，为大花龙胆的资源保护、物种多样性研究提供依据，也为规范药材市场提供了保障。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为大花龙胆四个居群的地理坐标图

图2为大花龙胆原植物图片图

图3为大花龙胆生境图

图4为高山龙胆与岷县龙胆五个居群的地理坐标图

图5为居群GSW中高山龙胆原植物图

图6为居群GSY中高山龙胆原植物图

图7为居群MXH中岷县龙胆原植物图

图8为居群MXR中岷县龙胆原植物图

图9为居群MXB中岷县龙胆原植物图

图10为岷县龙胆DNA(左)、高山龙胆DNA(中)及大花龙胆DNA(右)图

图11为不同退火温度下样品DHL1、MXR1的PCR产物扩增结果图

图12为居群MXB 15样品的ITS2-PCR产物的扩增结果图

图13为基于ITS2序列构建的58份大花龙胆样品的NJ系统聚类树图

图14为基于ITS2序列构建的高山龙胆与岷县龙胆NJ系统聚类树图

图15为基于ITS2序列构建的大花龙胆及其混伪品的NJ聚类树图

图16为基于ITS2序列构建的大花龙胆及其混伪品的UPGMA聚类树图

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1本发明鉴别大花龙胆与混伪品的方法

1、材料来源、仪器与试剂

1.1材料来源

大花龙胆四个居群的植物形态外观一致，均为“高5～7cm，莲座丛叶发达，花多单生枝顶，花冠上部具蓝灰色或棕灰色条纹和斑点”。各居群命名方式主要依据采样地点而定。具体见表1。大花龙胆四个居群的地理坐标见图1。大花龙胆植物形态见图2，生存环境见图3。

本研究参考《中国高等植物》有关两物种记载，结合野外调查结果，将“株高15～30cm，花1～8朵，花梗长达4cm”的植物定种为岷县龙胆，“株高3～10cm，花1～6朵，无花梗或具短花梗”的植物定种为高山龙胆。高山龙胆两个居群命名方式依据植物形态特征而定，岷县龙胆三个居群依据采样地点命名。具体见表1。高山龙胆与岷县龙胆五个居群的地理坐标见图4。各居群中原植物形态见图5～9。

1.2仪器与试剂

Tissuelyser-48全自动样品快速研磨仪(上海净信科技)、单道移液器(Eppendorf，德国)、DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)、5424R离心机(Eppendorf，德国)、微量分光光度计(Healthcare Bio-Sciences AB)、JY300HE电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)、JY300HE电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)、T100^TMPCR仪(BIO-RAD，新加坡)、721BR08817凝胶成像系统(BIO-RAD，美国)。

DP305植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)、琼脂糖(SIGMA-ALDRICH)、2×Es TaqMasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)、D2000DNA Maker(天根生化科技有限公司)。

2、实验方法

2.1DNA提取及质量检测

取样品叶片，提取DNA：叶片为高原上采集的新鲜叶片，用硅胶快速干燥后，放入-70℃低温箱中保存后，备用。

提取样品叶片DNA时采用全自动样品快速研磨仪代替人工研磨，使叶片细胞壁破碎完全，以释放细胞内含物。其余步骤按试剂盒要求进行。

DNA质量检测：

①取2μL DNA样品用微量分光光度计测定其在260nm和280nm处的OD值及DNA浓度。

②取5μLDNA样品与1μL 6×Loading Buffer混合均匀，在1％琼脂糖凝胶上于120V 220MA条件下电泳20min检测DNA质量。

2.2引物设计

设计正向引物ITS2F(SEQ ID NO:1)：

5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’

反向引物ITS3R(SEQ ID NO:2)：

5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，

均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

2.3PCR反应体系及扩增程序

反应体系设定为：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，正向和反向引物(2.5μmol/L)各1.0μL，根据模板浓度不同DNA用量在1.0～3.0μL之间，其余用无菌双蒸水补足体系至25μL。

PCR扩增程序：94℃，变性5min；94℃，变性30s，最佳退火温度下退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

扩增产物保存于-20℃冰箱。

2.4引物最佳退火温度的考察

调整退火温度，将退火温度设定在48℃～58℃之间，PCR仪自动生成A＝58℃、B＝57.2℃、C＝56℃、D＝54.1℃、E＝51.7℃、F＝49.9℃、G＝48.7℃、H＝48℃共8个温度梯度，根据不同温度下PCR产物的电泳图谱，挑选出ITS2引物的最优退火温度。

2.5PCR产物的检测

取PCR扩增产物5μL，采用最佳琼脂糖浓度2.0％，电泳45min，凝胶中含4％的Goldview核酸染料，电极缓冲液为1×TAE，电压不超过5V/cm，以D2000DNA Maker作为相对分子质量，待电泳结束、冲洗干净后在美国BIO-RAD生产的721BR08817凝胶成像系统上观察记录，保存图像。

2.6PCR扩增产物DNA片段测序及数据分析

PCR扩增产物的DNA片段由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序完成并应用Contig Express软件对序列进行校对拼接，获得ITS2序列。

使用Clustal W(Version2.1)软件对实验所得序列进行同源性比对。利用MEGA(Version5.05)软件寻找SNP位点，运用K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算各样本之间的种内遗传距离，采用邻接法(Neighbor Joining，NJ)构建系统聚类树。

3、结果分析

3.1DNA质量检测

微量分光光度计检测样品DNA纯度结果显示，样品中提取的DNA在260nm和280nm下光密度比值均在1.7～1.9之间，纯度较高。

微量分光光度计检测所有样品DNA浓度均在18.5ng/μL～78.5ng/μL之间，用TE缓冲液稀释DNA浓度至20ng/μL，放于-20℃冰箱中备用。

采用1％琼脂糖凝胶检测DNA质量，结果如图10。

可见，所有样品的DNA条带完整、明亮、清晰、整齐、无明显的拖尾现象、基本没有降解，所提DNA质量符合分子生物学实验要求。3.2最佳退火温度的考察

采用样品DHL1、MXR1对PCR反应的最佳退火温度进行考察，PCR产物电泳检测结果如图11，A＝58℃、B＝57.2℃、C＝56℃、D＝54.1℃、E＝51.7℃、F＝49.9℃、G＝48.7℃、H＝48℃，样品DHL1在B、C、D温度下，条带更为明亮。样品MXR1在F退火温度下无扩增条带，在A、B、D、H退火温度下扩增的条带清晰明亮度不济在C、H退火温度下扩增的条带清晰。综合样品DHL1和MXR1的PCR产物电泳检测结果，将C＝56℃作为ITS2分子标记的最佳退火温度。

3.3PCR扩增产物的检测

在2.0％的琼脂糖凝胶浓度下，检测PCR产物，结果以居群MXB中15个样品的ITS2扩增图谱为例说明，具体见图12。居群MXB中15个样品扩增的ITS2片段大小约500bp，扩增条带特整齐、清晰、明亮、特异性单一，符合ITS2分子标记实验要求。

3.4ITS2序列测定结果

3.4.1大花龙胆居群内的ITS2序列结果

对大花龙胆四个居群58个样品的PCR产物进行直接测序，应用Contig Express软件对序列进行校对拼接，获得ITS2序列。

对ITS2序列进行同源性比对，结果显示其相似性达99.99％。ITS2序列长度为464～477bp，平均长度为468.4bp，个体间存在长度多态性；序列GC量为55.8％～56.0％，平均达55.9％，基本无差异。

所有大花龙胆样品的ITS2中均包含下述序列：(SEQ ID NO:3)

ATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCC

CGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTC

GCCCCCCCAACACCGTGCATGAATTCATGCCGGTCGTCGGAGGGGCGGAT

ATTGGCTTCCCGTGCTTCGGTGCGGCTGGCCTAAATTCAAGTCCCTTGCG

ACGGACACGACGACAAGTGGTGGTTGAATTACTCAACTAAGGTGCTGTCG

CGCGTTGACCCGTCGGATGAGGAGACTTCTTTGACCCTAACGCATGTGTC

GTCACGACGTATGCCACGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGATTACCCGC

TGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCC

CCTAGTAACGGCGAGCGAACCGGGAACAGCCCAAGCTTAAAATCAGTCGA

CTTCGTCGTCTGAATT

采用邻接法(Neighbor Joining，NJ)对所有大花龙胆样品构建系统聚类树，结果显示所有样品聚成一类(图13)。

结果表明，本发明SEQ ID NO:1-2所示的引物对，扩增的大花龙胆ITS2序列高度一致，对不同环境、地理分布的大花龙胆居群均能扩增出同样的SEQ ID NO:3所示序列。

3.4.2高山龙胆与岷县龙胆的ITS2序列

对高山龙胆2个居群共27个样品的PCR产物进行直接测序，应用Contig Express软件对序列进行校对拼接，获得ITS2序列。通过MEGA(Version6.06)中Clustal W程序对序列进行同源性匹配，并寻找序列中的SNP位点。ITS2片段长度为376bp，其中保守位点121处，变异位点277处，信息位点255处，GC含量基本无差异，在59.2％～59.4％之间，平均为59.3％。采用DNAsp5.10.01软件对遗传多样性进行测定，结果发现，GSW居群内的遗传多样性为0.3528，GSY居群内的遗传多样性为0.2839，两个居群间的核苷酸多态性为0.3738。

对岷县龙胆3个居群45个样品的ITS2序列进行同源比对，结果显示岷县龙胆45个个体的ITS2序列长度为339bp，保守位点92个，变异位点261个，信息位点247个，GC含量为57.7％～58.3％，平均为57.9％。DNAsp5.10.01分析显示，MXB居群内的核苷酸多态性最低，为0.0023，MXR居群内的核苷酸多态性最高，为0.2993，MXH居群内的核苷酸多样性为0.2314，3个居群间的核苷酸多态性为0.3068。

运用MEGA(Version6.06)软件中的K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算高山龙胆与岷县龙胆72份样本ITS2序列之间的遗传距离。结果显示高山龙胆与岷县龙胆种间及同种不同居群间遗传距离均为0.0000～0.9984。

采用邻接法(Neighbor Joining，NJ)对高山龙胆与岷县龙胆72份样品的ITS2序列构建系统聚类树，见图14。

结果显示，NJ树主要分为两支，而每支上均有高山龙胆、岷县龙胆(GSW、GSY、MXH、MXR四个居群)的不同个体，仅有MXB居群的15个个体只在一个分支上。

说明高山龙胆、岷县龙胆二者存在不同居群间个体的交叉，通过本发明的IST2序列无法区分高山龙胆与岷县龙胆。

3.4.3大花龙胆与其混伪品之间亲缘关系的ITS2分析

大花龙胆五个居群所有样品的ITS2序列相同，故大花龙胆的ITS2序列命名为G.szechenyii。

由于高山龙胆与岷县龙胆的ITS2序列分别有两种排列形式，故将高山龙胆与岷县龙胆的两种ITS2序列，分别命名为G.algida-Ⅰ、G.algida-Ⅱ、G.purdomii-Ⅰ、G.purdomii-Ⅱ。

粗根龙胆Gentianacallistantha Diels et Gilg：《中国高等植物》(第九卷)已经依据植物形态将其正名为大花龙胆，即将粗根龙胆与大花龙胆两品种合并为一个种。

3.4.3.1遗传距离分析

从GenBANK数据库中下载已有高山龙胆G.algida Pall.的ITS2序列及大花龙胆常见混伪品高冷龙胆Gentiana frigidHaenke、滇龙胆草GentianarigescensFranch.exHemsl.、秦艽Gentianamacrophylla Pall.、麻花艽Gentianastraminea Maxim.的ITS2序列，物种信息见表2。

表2从GenBANK数据库中下载物种的信息表

将测定所得的大花龙胆、高山龙胆、岷县龙胆的ITS2序列与从GenBank数据库中调取的大花龙胆易混品种的ITS2序列一起，通过MEGA6.06构建系统发育树。选取龙胆科大钟花属大钟花Megacodonstylophorus(C.B.Clarke))H.Smith，龙胆科花锚属椭圆叶花锚HaleniaellipticaD.Don作为外类群。

通过MEGA(Version6.06)对所有序列进行同源比对，同源序列中总序列长度为221bp，保守序列143处，简约信息位点43处，单变异位点32处，变异位点共75处，变异位点占总位点的33.9％。GC含量在56.6％～63.2％之间，平均为59.3％。在K2P(Kimura2-Parameter)模型下建立遗传距离矩阵，结果见表3。

由表3可见，大花龙胆与其它品种的遗传距离为0.0094～0.2608，种间变异明显，而大花龙胆居群之间序列稳定。

而高山龙胆-Ⅰ与岷县龙胆-Ⅰ两种间的遗传距离；高山龙胆-Ⅱ、岷县龙胆-Ⅱ与高冷龙胆三者的遗传距离最小，均为0，无法进行区分。

因此，基于IST2序列的遗传距离分析法可以用于鉴别大花龙胆与其它易混品。

3.4.3.2聚类分析：

采用邻接法(Neighbor joining，NJ)及非加权组平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)对所有物种构建系统发育树，聚类时以Bootstrap做1000次可信度分析，结果见图15、16。

通过NJ法、UPGMA法对大花龙胆及易混品种构建的系统发育树可以发现，聚类主要分为五支，第一支由龙胆属高山龙胆组的高山龙胆-Ⅰ、高山龙胆-Ⅱ、岷县龙胆-Ⅰ、岷县龙胆-Ⅱ、高山龙胆、高冷龙胆组成。第二支由龙胆属多枝组滇龙胆草自成一支。第三支由龙胆属多枝组大花龙胆与粗根龙胆组成，大花龙胆与粗根龙胆的遗传距离较近，为0.0094，这与《中国高等植物》依据植物形态将大花龙胆与粗根龙胆两品种合并为一个种的结果相一致。第四支由龙胆属秦艽组中的秦艽和麻花艽组成。第五支由龙胆科大钟花属大钟花和花锚属椭圆叶花锚组成，所有龙胆属品种与花锚属椭圆叶花锚均距离较远。

NJ与UPGMA聚类结果基本一致，与传统经典分类中的品种亲缘关系呈现一致性，本发明的IST2序列，可以区分物种是否为大花龙胆，但无法将高山龙胆、岷县龙胆与高冷龙胆三者区分开。

因此，SEQ ID NO:1-2所示的引物对扩增的IST2序列，可以区分大花龙胆及其混伪品。

综上，本发明SEQ ID NO:1-2所示的引物对，可以准确鉴别大花龙胆真伪，且操作简单、准确可靠，为规范药材市场提供了保障，应用前景良好。