本发明涉及载体构建领域，尤其涉及一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法。
背景技术：
载体构建指的是把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。传统的载体构建过程中，基因片段与载体的连接大多数是基于T4DNA连接酶，它在存在辅酶ATP和MgCl2的条件下催化粘端或平端双链DNA或RNA的5′-P末端和3′-OH末端之间形成磷酸二酯键，但是这个反应过程通常较慢，为达到最佳的连接效果通常需要过夜连接，而酶稳定性差，储存运输过程中其活性容易发生变化。目前，载体的构建有很多替代方式，基于牛痘拓扑异构酶I的载体构建方法有很大的应用前景，但是牛痘拓扑异构酶I的作用需要一段特殊的DNA序列5`ccctt，并切割/连接5`ccctt后的磷酸二酯键。如何在载体中加入这段特异地序列是个关键问题。常见的办法是使用特定的限制性内切酶切割质粒载体，载体露出粘性末端，再合成两条5`端磷酸化的单链引物，退火成为一个带有与载体粘性末端互补配对的粘性末端，再通过T4DNA ligase连接载体与接头。但是，这种方案载体生产的流程较长，特别是限制性内切酶处理过的线性载体与双链接头连接效率难以保证，因而载体制备费时费力。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法，该方法能够解决载体构建流程长，载体制备费时费力的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法，包括以下步骤：
1)在质粒上引入ccdB基因表达单元，得到合成质粒；
2)使用DNA聚合酶，通过PCR以引物A作为上下游引物，所述合成质粒为模板，进行大量扩增，产生线性前载体；并将所述线性前载体用琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶纯化；
3)将步骤2)得到的所述切胶纯化的线性前载体中加入T4DNA聚合酶和dATP，突出步骤2)得到的所述切胶纯化的线性前载体5`端；
4)在步骤3)得到的产物中加入引物B、引物C和NaCl充分混合，并在牛痘拓扑异构酶I的切割与连接，即得到零背景载体；
所述引物A中5`-3`的核酸序列为AAGGGCGAGACGCGAA(SEQ ID:1)；所述引物B中5`-3`的核酸序列为TTCGCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTG(SEQ ID:2)；所述引物C中5`-3`的核酸序列为CAACACTATCGGAAT(SEQ ID:3)。
优选地，所述ccdB基因表达单元两端均有一段双链序列M；所述双链序列M从3′-5′的前16bp碱基不含腺嘌呤，第17位与第18位含有两个腺嘌呤。
优选地，所述双链序列M为
优选地，步骤3)中所述T4DNA聚合酶和dATP在35～40℃处理线性前载体两端；所述dATP在反应体系中的浓度为0.8～1.2mM。
优选地，步骤3)和步骤4)之间还包括将步骤3)得到的产物在70～80℃下加热15～25min。
优选地，步骤4)中所述5`端突出的线性前载体的分子量，与所述引物B和所述引物C的总分子量比为1：45～55；所述引物B和所述引物C在反应体系中的浓度均为0.8～1.2mM；所述NaCl的浓度为1.5～2.5M，体积为反应体系的1/12～1/8。
优选地，所述牛痘拓扑异构酶I的切割与连接条件为在水浴锅中加热至85～95℃后自然冷却。
本发明提供基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法，引物B中5`-3`的核酸序列为TTCGCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTG(SEQ ID:2)；引物C中5`-3`的核酸序列为CAACACTATCGGAAT(SEQ ID:3)，这两种引物通过碱基互补配对与5`端突出的线性前载体结合，在牛痘拓扑异构酶I的切割与连接能力的作用下能够实现零背景，避免T4DNA连接酶连接反应中发生的非目的连接，提高了线性载体与双链接头连接效率高，简化构建流程，解决了载体构建流程长，载体制备费时费力的问题。
具体实施方式
本发明公开了一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所述类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及引用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法，包括以下步骤：
1)在质粒上引入将ccdB基因表达单元，得到合成质粒；
2)使用DNA聚合酶，通过PCR以引物A作为上下游引物，合成质粒为模板，进行大量扩增，产生线性前载体；并将线性前载体用琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶纯化；
3)将步骤2)得到的切胶纯化的线性前载体中加入T4DNA聚合酶和dATP，突出步骤2)得到的切胶纯化的线性前载体5`端；
4)在步骤3)得到的产物中加入引物B、引物C和NaCl充分混合，并在牛痘拓扑异构酶I的切割与连接，即得到零背景载体；
引物A中5`-3`的核酸序列为AAGGGCGAGACGCGAA(SEQ ID:1)；引物B中5`-3`的核酸序列为TTCGCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTG(SEQ ID:2)；引物C中5`-3`的核酸序列为CAACACTATCGGAAT(SEQ ID:3)。
上述技术方案中，ccdB基因表达是一种毒性蛋白，能够干扰大肠杆菌DNA促旋酶，从而抑制细菌生长并杀死细菌；大肠杆菌DB3.1含有gyrA462基因，对ccdB基因表达产物毒性具有抵抗作用，能够方便质粒的转化及质粒提取，同时能够降低改造后的载体在一般大肠杆菌中转化造成的背景。
T4DNA聚合酶具有较强的3′→5′的外切核酸酶活性，同时在在模板及引物A存在的条件下，催化与模板互补的脱氧核苷酸依次选择性地连接在引物的3′-OH末端上的反应，即具有5`→3`聚合酶活性。使用T4DNA聚合酶处理线性前载体两端，使线性前载体的两个5`端突出。由于T4DNA聚合酶有5`→3`聚合酶活性在dNTP存在的情况下远强于3′→5′的外切核酸酶活性，且反应体系中仅有dATP存在，因此在由3′→5′消化时在序列的第一个A碱基处终止。也由于仅有dATP存在，5`→3`聚合酶活性也被终止。
引物B、引物C通过碱基互补配对与5`端突出的线性前载体结合，在牛痘拓扑异构酶I的切割与连接能力的作用下能够实现零背景，即不会有载体的自连。
在本发明的实施例中，合成质粒序列如下：
CCTGTTCTCGTCAGCAAAAGAGCCGTTCATTTCAATAAACCGGGCGACCTCAGCCATCCCTTCCTGATTTTCCGCTTTCCAGCGTTCGGCACGCAGACGACGGGCTTCATTCTGCATGGTTGTGCTTACCAGACCGGAGATATTGACATCATATATGCCTTGAGCAACTGATAGCTGTCGCTGTCAACTGTCACTGTAATACGCTGCTTCATAGCATACCTCTTTTTGACATACTTCGGGTATACATATCAGTATATATTCTTATACCGCAAAAATCAGCGCGCAAATACGCATACTGTTATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCTAACTCAAAATCCACACATTATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGGAGTCGAATAAGGGCGACACGCGAATTCCGATAACAAGCATCAGGACTGCAGCGAGCCTCAGACACTGGCCGTCGTTTTACACAATCAAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGCTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCATCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGTGATTACATTTGGGCCCTCATTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAACGGAATAAGTGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAAGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTCTGCTATGGAAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATCGTCAGTATTGACTGCAGGCAGACGCGACATCGAATTCGCGTGTCGCCCTTATTCGACTCGCCTGACATTTATATTCCCCAGAACATCAGGTTAATGGCGTTTTTGATGTCATTTTCGCGGTGGCTGAGATCAGCCACTTCTTCCCCGATAACGGAGACCGGCACACTGGCCATATCGGTGGTCATCATGCGCCAGCTTTCATCCCCGATATGCACCACCGGGTAAAGTTCACGGGAGACTTTATCTGACAGCAGACGTGCACTGGCCAGGGGGATCACCATCCGTCGCCCGGGCGTGTCAATAATATCACTCTGTACATCCACAAACAGACGATAACGGCTCTCTCTTTTATAGGTGTAAACCCTAAACTGCATTTCACCAGCC(SEQ ID:4)。
在本发明的实施例中，ccdB基因表达单元两端均有一段双链序列M，双链序列M从3′→5′的前16bp碱基不含腺嘌呤，第17位与第18位含有两个腺嘌呤；在本发明的其他实施例中，双链序列M为在本发明的实施例中，T4DNA聚合酶和dATP在35～40℃处理线性前载体两端；在本发明的其他实施例中，T4DNA聚合酶和dATP在37℃处理线性前载体两端。
在本发明的实施例中，步骤3)和步骤4)之间还包括将步骤3)得到的产物在70～80℃下加热15～25min；在本发明的其他实施例中，步骤3)和步骤4)之间还包括将步骤3)得到的产物在75℃下加热20min。
在本发明的实施例中，5`端突出的线性前载体的分子量，与引物B和引物C的总分子量比为1：45～55，dATP在反应体系中的浓度为0.8～1.2mM；在本发明的其他实施例中，5`端突出的线性前载体的分子量，与引物B和引物C的总分子量比为1：50，dATP在反应体系中的浓度为1mM。
在本发明的实施例中，牛痘拓扑异构酶I的切割与连接条件为在水浴锅中加热至85～95℃后自然冷却；在本发明的其他实施例中，牛痘拓扑异构酶I的切割与连接条件为在水浴锅中加热至90℃后自然冷却。
在本发明的实施例中，NaCl的浓度为反应体系的1.5～2.5M，体积为反应体系的1/12～1/8；在本发明的其他实施例中，NaCl的浓度为反应体系的2M，体积为反应体系的1/10。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种基于牛痘拓扑异构酶I的零背景载体构建方法进行详细描述。
以下实施例中所用的原料均为市售。
实施例
1)在质粒上引入将ccdB基因表达单元，得到合成质粒；其中，ccdB基因表达单元两端均有一段双链序列M；双链序列M从3′→5′的前16bp碱基不含腺嘌呤，第17位与第18位含有两个腺嘌呤；合成质粒的序列为：
CCTGTTCTCGTCAGCAAAAGAGCCGTTCATTTCAATAAACCGGGCGACCTCAGCCATCCCTTCCTGATTTTCCGCTTTCCAGCGTTCGGCACGCAGACGACGGGCTTCATTCTGCATGGTTGTGCTTACCAGACCGGAGATATTGACATCATATATGCCTTGAGCAACTGATAGCTGTCGCTGTCAACTGTCACTGTAATACGCTGCTTCATAGCATACCTCTTTTTGACATACTTCGGGTATACATATCAGTATATATTCTTATACCGCAAAAATCAGCGCGCAAATACGCATACTGTTATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCTAACTCAAAATCCACACATTATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGGAGTCGAATAAGGGCGACACGCGAATTCCGATAACAAGCATCAGGACTGCAGCGAGCCTCAGACACTGGCCGTCGTTTTACACAATCAAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGCTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCATCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGTGATTACATTTGGGCCCTCATTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAACGGAATAAGTGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAAGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTCTGCTATGGAAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATCGTCAGTATTGACTGCAGGCAGACGCGACATCGAATTCGCGTGTCGCCCTTATTCGACTCGCCTGACATTTATATTCCCCAGAACATCAGGTTAATGGCGTTTTTGATGTCATTTTCGCGGTGGCTGAGATCAGCCACTTCTTCCCCGATAACGGAGACCGGCACACTGGCCATATCGGTGGTCATCATGCGCCAGCTTTCATCCCCGATATGCACCACCGGGTAAAGTTCACGGGAGACTTTATCTGACAGCAGACGTGCACTGGCCAGGGGGATCACCATCCGTCGCCCGGGCGTGTCAATAATATCACTCTGTACATCCACAAACAGACGATAACGGCTCTCTCTTTTATAGGTGTAAACCCTAAACTGCATTTCACCAGCC(SEQ ID:4)。
2)使用DNA聚合酶，通过PCR以AAGGGCGAGACGCGAA(SEQ ID:1)作为上下游引物，合成质粒为模板，大量扩增出，产生线性前载体；并将线性前载体用琼脂糖凝胶电泳分离，并切胶纯化；
3)将切胶纯化的线性前载体中加入T4DNA聚合酶在37℃处理线性前载体两端，使线性前载体的两个5`端突出，和dATP，突出的切胶纯化的线性前载体的5`端；同时在反应体系中加入dATP(dATP在反应体系中的浓度为1mM)，使得线性前载体序列的第一个A碱基处终止，并在75℃，加热20min使T4DNA聚合酶失活，纯化5`端突出的线性前载体。
4)再加入核酸序列(5`-3`)TTCGCGTGTCGCCCTTATTCCGATAGTG(SEQ ID:2)的引物B和核酸序列(5`-3`)CAACACTATCGGAAT(SEQ ID:3)的引物C(引物B和引物C的分子量之和是5`端突出的线性前载体分子量的50倍，引物B和引物C在反应体系中的浓度均为10μM)，再加入2M NaCl(NaCl的体积为反应体系的1/10)，充分混匀；最后加入牛痘拓扑异构酶I，并将反应体系在水浴锅中加热至90℃后自然冷却，即得到零背景载体。
构建的载体连接外源片段能够达到零背景，避免T4DNA连接酶连接反应中发生的非目的连接，提高了线性载体与双链接头连接效率高，简化了构建流程，使得载体制备简单，解决了载体构建流程长，载体制备费时费力的问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。