本发明涉及微生物制剂领域,尤其是一种用于垃圾除臭的EM菌液制备方法。
背景技术:
:EM菌(EffectiveMicroorganisms)是由多种有益微生物(主要是光合细菌、乳酸菌、酵母菌、丝状真菌和放线菌)复合而成的有机组合,可在使用处形成良好的微生态环境,因而可以应用于环保、种植、畜牧、水产、饲料及人体家庭保健等方面,起到抑制病原菌、除异臭、改良土壤、改善水质、增强抗病性、促生长、改善产品品质等功效。目前,环保、种植、畜牧等行业所用的EM菌并没有本质上的差异,只是不同用户所使用的品牌不同,其中的微生物种类及各菌种比例差异不显著。这种同一性使EM菌的针对性使用效果不理想,或者使用量过大,使用成本较高。EM菌的菌种组成复杂,其中的光合细菌等多种微生物对除臭无作用,但在除臭过程中发挥重要作用的酵母、乳酸菌以及产生抗生素的微生物含量过低;而且由于菌种间的拮抗作用,传统的发酵方法生产的产品中菌体浓度通常较低,培养时间长,生产成本较高。市场急需一种专一性高、除臭效果好、用量少、成本低的EM菌产品。技术实现要素:本发明的目的在于提供一种在垃圾处理、畜牧养殖、污水处理等过程中除臭用的EM菌液制备方法,该菌液中活菌总数不低于109cfu/mL。为了达成上述目的,本发明的技术方案如下:一种除臭用EM菌液制备方法,将常规的EM菌种分为DFA和DFB两个部分,分别在糖蜜培养基中培养48小时;其中:DFA培养温度为37℃,不通气培养;DFB培养温度为30℃,通气培养;培养后DFA和DFB按9:1的体积比混合,随后,30℃密闭发酵,培养24h,即得除臭用EM菌液。其中:DFA为不含酵母菌,以细菌和放线菌为主要成分的复合菌种;DFB为以酵母菌和丝状真菌为主要成分的复合菌种。本发明所使用的出发菌液为市售EM菌液。所述DFA的制备,包括以下步骤:取常规EM菌液4℃下静置30天后的上层液体按1%接种至无菌的糖蜜培养基(按质量百分比计,糖蜜8%,蛋白胨2%,K2HPO40.6%,CaCO33%,自然pH)中,按90%装液量装入锥形瓶中,密闭发酵,37℃振荡培养7天后显微镜检,取无酵母的样品作DFA组分一;取常规EM菌液按1%接种量接种至高温灭菌的LB培养基(按质量百分比计,胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,Nacl1%,培养基pH控制在7.4)中,按90%装液量装入锥形瓶中,密闭发酵,37℃振荡培养7天后传代,重复上述操作,取显微镜检无酵母菌的样品作组分二;利用LB固体培养基(按质量百分比计,胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,Nacl1%,琼脂1.0%~1.5%,培养基pH控制在7.4)与PDA培养基(按质量百分比计,马铃薯20%,葡萄糖2%,琼脂1.5%~2.0%,自然pH)分离常规EM中菌种,除酵母菌外,分别培养分离得到的菌株后按相同比例接种至无菌的糖蜜培养基中,按90%装液量装入锥形瓶中,密闭发酵,自然协调菌种比例,37℃振荡培养7天作为组分三;以上所得的三种无酵母发酵液均按3%接种量混合接种至高温灭菌的糖蜜培养基(培养基配方同前)中,按90%装液量装入锥形瓶中,密闭发酵,37℃振荡培养3天即得新鲜DFA,新鲜DFA与无菌保护液(蔗糖100g/L、脱脂奶粉100g/L)等体积混合后-80℃真空冷冻干燥24h制成菌粉。所述DFB的制备:取常规EM菌液4℃下静置30天后的菌泥,按1%接种量接种至无菌的糖蜜培养基(培养基配方同前)中,按25%装液量装入锥形瓶中,通氧发酵,30℃振荡培养3天即得新鲜DFB,新鲜DFB与无菌保护液(蔗糖100g/L、脱脂奶粉100g/L)等体积混合后-80℃真空冷冻干燥24h制成菌粉。新鲜DFA菌液按2%量直接接种至无菌的糖蜜培养基(培养基配方同前)中,冻干菌粉需经种子培养(采用糖蜜培养基,培养基配方同前),90%装液量,1%接种量,37℃密闭振荡培养)24h后按10%量接种至无菌的糖蜜培养基(培养基配方同前)中,发酵罐装液量为70%,密闭发酵,每隔24小时搅拌10分钟(搅拌时打开放气阀放出气体,防止过压),37℃培养48小时;新鲜DFB菌液按2%量直接接种至无菌的糖蜜培养基(培养基配方同前)中,冻干菌粉需经种子培养(采用糖蜜培养基,培养基配方同前),25%装液量,1%接种量,30℃通气振荡培养)24h后按10%量接种至无菌的糖蜜培养基(培养基配方同前)中,30℃通气搅拌/振荡培养48小时;发酵后的DFA和DFB按9:1(V/V)混合后按70%装液量装入发酵罐或无菌密闭容器,30℃密闭发酵,每隔6小时搅拌10分钟(搅拌时打开放气阀放出气体,防止过压)培养24h即得除臭用EM菌液。本发明使用时,根据待处理样品差异选择不同的使用方法。待处理样品为固体,如垃圾、粪便或养殖场时,将除臭用EM菌液用20-30℃温水稀释10倍,静置1h后喷洒表面,按照其臭味浓烈程度,原液使用量为待处理样品质量的0.1%-1%。待处理样品为液体,如生活污水、便池、工业废水等时,将除臭用EM菌液用20-30℃温水稀释3倍,静置1h后倾倒至待处理液体中,按照其臭味浓烈程度,原液使用量为待处理样品质量的0.001%-0.1%。本发明菌液中酵母类真菌占总微生物比例为市售EM菌液中的10倍以上。本发明通过通气培养,将酵母菌和霉菌等在除臭过程中起主要作用的好氧菌从EM菌中分离出来制成DFB,不含酵母菌的EM菌不通气培养制成DFA,DFA和DFB分别培养至高菌体浓度后复配培养制成除臭用EM菌,稀释后喷洒或倾倒至待处理样品中。本发明的有益效果是:(1)菌体浓度高;在培养的前48h内无酵母菌和其他菌株间营养的竞争以及代谢产物(乙醇、乙酸和乳酸等)所导致的相互之间的抑制作用,并为生长需求不同的菌种提供了不同的培养条件,使菌体生长旺盛,成品中活菌总数可达109数量级以上。(2)生产周期短,72小时即可完成发酵。(3)提高了对除臭有显著效果的酵母和霉菌的比例,经检测,本产品菌液中酵母类真菌占总微生物比例为市售EM菌液中的10倍以上,增强了EM菌的除臭效果。具体实施方式实施例一:液体菌种制备与发酵。步骤一、DFA的制备:1、取EM菌液500mL,分装至25支无菌试管中,密封于4℃下静置30天后的取上层液体按1%分别接种至无菌的糖蜜培养基中,按90%装液量装入锥形瓶中,每组2个平行样,密闭发酵,37℃振荡培养7天后显微镜检,得到无酵母的样品按相同体积比混合后作为组分一。2、取EM菌液按1%接种量接种至高温灭菌的LB培养基中,按90%装液量装入锥形瓶中,每组10个平行样,密闭发酵,37℃振荡培养7天后传代,重复上述操作至第三次传代得到2个镜检无酵母菌样品混合作为组份二。3、利用LB固体培养基与PDA培养基分离纯化EM中菌种,得到15株细菌、2株放线菌、8株霉菌、1株酵母菌,除酵母菌与霉菌外,分别在LB液体培养基中培养48h后按0.5%(V/V)接种至无菌的糖蜜培养基中,按90%装液量装入锥形瓶中,密闭发酵,自然协调菌种比例,37℃振荡培养7天作为组分三。以上所得的三种无酵母发酵液均按3%接种量混合接种至无菌的糖蜜培养基中,按90%装液量装入锥形瓶中,密闭发酵,37℃,100rpm振荡培养7天得DFA。步骤二、DFB的制备:取EM菌液4℃下静置30天后的菌泥,按1%接种量接种至无菌的糖蜜培养基中,按25%装液量装入锥形瓶中,30℃,200rpm振荡培养3天得DFB。步骤三、取DFA按2%接种量接种至无菌的糖蜜培养基中,按70%装液量装入发酵罐,密闭发酵,每隔24h搅拌30min,37℃培养48h,经检测,活菌总数达1.53×109cfu/ml。取DFB按2%接种量接种至无菌的糖蜜培养基中,30℃通气搅拌培养48h,经检测,酵母菌浓度达9.30×108cfu/ml,总活菌数达1.78×109cfu/ml。发酵后的DFA和DFB按9:1混合后装入空消后的发酵罐,装液量70%,30℃密闭发酵,每隔6小时搅拌10分钟,培养24h后得除臭用高密度EM菌液,经检测,活菌总数达3.73×109cfu/ml,其中酵母菌总数为1.65×109cfu/ml。实施例二:固体菌种制备与发酵。DFA冻干粉剂的制备与培养:DFA新鲜菌液与无菌保护液按1:1(V/V)混合后于-80℃预冻4h,预冻后的样品于-80℃真空冷冻干燥48h,检测其含水量为3.74%,菌体存活率为87.5%。取保存6个月的冻干菌粉按1%量接种至无菌的糖蜜培养基,按90%装液量装入500mL锥形瓶,37℃,150rpm振荡培养1天后按10%接种量接种至50L发酵罐中,接种后装液量约为35L,培养基为糖蜜培养基,每隔24h搅拌30min,37℃培养48h,经检测,活菌总数达1.27×109cfu/ml。DFB冻干粉剂的制备与培养:DFB新鲜菌液与无菌保护液按1:1(V/V)混合后于-80℃预冻4h,预冻后的样品于-80℃真空冷冻干燥48h,检测其含水量为3.37%,菌体存活率为84.3%。取保存6个月的冻干菌粉按1%量接种至无菌的糖蜜培养基,容器为500mL锥形瓶,25%装液量,30℃,200rpm振荡培养1天后按10%接种量接种至5L发酵罐中,接种后装液量约为3.5L,培养基为糖蜜培养基,30℃下,300rpm通气搅拌培养,通气比1:1,培养48h,经检测,活菌总数达1.96×109cfu/ml,其中酵母菌总数1.22×109cfu/ml。从DFA发酵罐内放料3.5L,将3.5LDFB导入DFA发酵罐内,30℃密闭发酵,每隔6小时搅拌10分钟,培养24h后得除臭用高密度EM菌液,经检测,活菌总数达4.65×109cfu/ml,其中酵母菌总数为1.95×109cfu/ml。实施例三:固体垃圾除臭实验。从生活区垃圾场采集垃圾100kg,其组成包括废纸、塑料制品、动物内脏、食物残渣等,搅拌混匀后均匀分为5份,每份20kg,分别装入5个100kg塑料桶中,桶盖上留有8cm2气窗,分别编号1-5。处理方法:1号;取除臭用EM菌液,离心、过滤除菌后取20g滤液加入30℃温水180g,混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面,盖上桶盖。2号;取除臭用EM菌液20g加入30℃温水180g,混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面,盖上桶盖。3号;取除臭用EM菌液,离心、过滤除菌后取200g滤液加入30℃温水1800g,混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面,盖上桶盖。4号;取除臭用EM菌液200g加入30℃温水1800g,混匀静置1h后均匀喷洒至垃圾表面,盖上桶盖。5号;不作处理,直接盖上桶盖。将5个桶置于室外,3d后取气体样品检测其中硫化氢和氨(GB/T14678-93,GB/T14679-93)。采气时用硅胶管伸入桶中部采集气体。实验过程中无下雨,温度16-28℃,无阳光直射,检测结果如表1所示。表1除臭实验检测结果实验组氨(mg/m3)硫化氢(mg/m3)14.782.4821.140.2435.262.7140.440.1154.652.53结果分析:除臭用EM菌液表现出良好的除臭效果,显著的降低了实验桶中的氨和硫化氢这两种主要的臭味形成气体,且氨和硫化氢的去除率随用量的升高而增加,通过2和1,4和3的对照可以看出,菌液的除臭作用依赖于其中的微生物。3中氨和硫化氢均高于1和5可能系菌液中残留的培养基促进了垃圾中产臭微生物的生长,同时3喷洒的水量较大,有助于产臭微生物的繁殖。当前第1页1 2 3