一种高效分离制备单一分子量透明质酸寡糖的方法与流程

本发明涉及一种高效分离制备单一分子量透明质酸寡糖的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)，俗称玻璃尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得，广泛用于医药、化妆品、食品等领域。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性。

透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。

根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×10⁶)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×10⁵-10⁶)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

透明质酸经过酶解得到的产物一般为多种O-HA的混合物，如果要制备不同糖残基数的O-HA，必须经过分离。Tawada等用阴离子交换色谱柱进行分离，将冻干的样品溶于蒸馏水，通过阴离子交换色谱柱将不同残基数的寡糖分离开，不同的O-HA片段用凝胶过滤脱盐，然后用离心超滤装置除菌除热原，得到不同大小的O-HA。Ikegami-Kawai等用聚丙烯酰胺凝胶色谱进行分离，此外还有凝胶渗透色谱法(GPC)、HPLC法等分离方法。O-HA经凝胶层析分离只能得到一定Mr范围的混合物，不能制得单一分子量的O-HA。O-HA经Bio-gel P6凝胶层析分离只能够将大分子HA分离出来。Dowex1×2强阴离子交换层析不能完全将不同Mr的O-HA分离出来。

技术实现要素：

本发明公开了一种利用离子交换柱实现单一分子量透明质酸寡糖的制备方法。

所述方法包括以下步骤：

(1)以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；

(2)使用离子交换柱HiPrep Q FF 16/10对透明质酸寡糖混合物进行分离纯化；

所述步骤(2)中，先使用10倍柱体积的缓冲液A冲洗柱子，再通过10倍柱体积的洗脱剂，以2mL/min的流速对色谱柱进行线性洗脱，；所述洗脱剂由缓冲液A、缓冲液B组成，其中NaCl浓度于100min内从0提高到0.2mol/L，收集、合并同一峰对应的洗脱液；所述缓冲液A是50mmol/L的pH 8.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，所述缓冲液B是pH 8.5的0.5mol/L的NaCl缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，缓冲液A的制备是称取3.75g甘氨酸溶解于500mL去离子水，用5MNaOH溶液调节pH至8.5,加去离子水定容至1L；缓冲液B的制备是称取29.22gNaCl溶于缓冲液A中，并定容至1L。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)是在发酵罐中加入900mL的水，并加入透明质酸酶3.5×10⁷U和透明质酸40g，并加水至1L，在45℃、转速为700rpm条件下反应，反应11小时后高温灭活。

本发明为解决规模化制备单一分子量透明质酸寡糖的的问题，采用生物酶法催化降解HA，将制备的寡糖规模化分离和纯化，实现了工业化生产制备单一分子量的透明质酸寡糖。本发明将单一分子量的透明质酸寡聚糖进行分离，在工业上用于制备单一寡聚透明质酸及其衍生体具有潜在而非常广泛的价值。

附图说明

图1是罐中酶活3.5×10⁴U/mL的分子量变化趋势图；

图2是水解产物的分离图；

图3是纯化出的HA4的质谱图；

图4是纯化出的HA6的质谱图；

图5是纯化出的HA8的质谱图；

图6是纯化出的HA10的质谱图；

图7是纯化出的HA12的质谱图；

图8是纯化出的HA14的质谱图。

具体实施方式

水解产物分离方法：

水解产物15000r/min离心20min后取上清，缓冲液A：50mmol/L，pH 8.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(称取3.75g甘氨酸溶解于500mL去离子水，用5M NaOH溶液调节pH至8.5,加去离子水定容至1L)；缓冲液B：pH 8.5，0.5mol/LNaCl缓冲液(称取29.22gNaCl溶于800mL缓冲液A中，并定容至1L)，使用柱子HiPrep 16/10Q FF(柱体积：20mL)美国GE公司。通过10倍色谱柱体积(CV)的洗脱剂，以2mL/min的流速对色谱柱进行线性洗脱，洗脱剂由缓冲液A、缓冲液B组成，其中NaCl浓度于100min内从0提高到0.2mol/L，AKTA蛋白纯化系统美国Amersham Biosciences公司。AKTA蛋白纯化系统配备有96孔板收集装置，每个孔收集1mL的洗脱液。分离结束后，将96孔板从AKTA中取出，将收集的溶液放入冰中保存。

水解产物的质谱检测方法：

洗脱样品15000r/min离心20min后取上清，稀释至1mg/mL上样。BEHAmide(100mm×2.1mm，1.7μm)美国Waters公司；Waters Maldi synpat Q-TOF MS美国Waters公司，色谱条件：ESI-MS条件；色谱仪：Waters Acquity UPLC；分析色谱柱：BEHAmide 2.1×100mm1.7μm，柱温：45℃，流速0.3mL/min，进样量1μL，流动相：A：甲酸铵，B：乙腈，离子方式：ESI。质谱条件：离子源参数ESI，雾化器压力：30psi；脱溶剂气体流速50L/hour；温度400℃；负离子模式。可检测出分离产物的成分。

实施例1规模化制备特定分子量透明质酸寡糖

以水蛭来源的透明质酸酶对大分子量透明质酸进行水解，大分子量透明质酸的起始分子量大小为1.21×10⁶Da。在发酵罐中加入900mL的水，并加入透明质酸酶3.5×10⁷U和透明质酸40g，最后加水至1L，在45℃、转速为700rpm条件下反应。每隔1小时取样并将样品在沸水中煮沸10分钟以将酶灭活，然后采用0.22μm的滤膜过滤，使用凝胶柱进行分子量测定，绘制出分子量变化趋势图。如图1所示的是，发酵罐中初始酶活3.5×10⁴U/mL条件下透明质酸分子量随时间的变化趋势图。

发酵罐在11小时高温灭活，水解产物进行分离纯化。将发酵罐中的水解样品离心15000rpm、20min，并通过0.22μm的水系膜过滤，取10ml样品，待缓冲液A将柱子冲洗10倍柱体积后，将样品注入AKTA系统。通过10倍色谱柱体积(CV)的洗脱剂，以2mL/min的流速对色谱柱进行线性洗脱，洗脱剂由缓冲液A、缓冲液B组成，其中NaCl浓度于100min内从0提高到0.2mol/L，AKTA蛋白纯化系统配备有96孔板收集装置，每个孔收集1mL的洗脱液。分离结束后，将96孔板从AKTA收集器中取出，如图2所示水解产物的离子交换图，将每个峰对应的96孔板中的洗脱液收集起来。将96孔板中收集的同一峰的洗脱液进行合并，合并后每一个峰的样品通过透析袋进行脱盐，之后将收集的样品在-80℃进行冷冻，在冷冻干燥机中进行冻干。

冻干后的样品使用咪唑硫酸法测定寡糖的纯度，其中HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的产物得率分别为75％、64.5％、55％、43.5％、43％、40.5％。HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的产物得率分别为94％、91％、88％、87.5％、85％、82％、80.5％。对纯化的样品进行质谱检测，如图3所示，是纯化出HA4的质谱图；如图4所示，是纯化出HA6的质谱图；如图5所示，是纯化出HA8的质谱图；如图6所示，是纯化出HA10的质谱图；如图7所示，是纯化出HA12的质谱图；如图8所示，是纯化出HA14的质谱图。